摘要：

原发性肝癌(简称肝癌)是人类最常见的恶性肿瘤之一,因其恶性程度高,预后差被称为"癌中之王".如今,全世界50%以上的新发和死亡肝癌患者发生在我国,每年我国大约有30万人因患肝癌死亡.随着人们对肿瘤微环境研究的深入,认为肿瘤是在肿瘤细胞与其周围所处的微环境共同作用下形成的,不再只局限于恶变的细胞上.肿瘤微环境是肿瘤在发生发展过程中所处的内环境,包括肿瘤细胞本身,基(间)质细胞,微血管及少量的浸润细胞[1].其中与肿瘤生成与发展的微环境最直接相关的是基质细胞.基质细胞作为肿瘤微环境中的重要组成部分,在肿瘤的发生发展过程中起着重要调节作用.肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSCs)是肝脏中最重要的基质细胞,HSCs的持续激活是肝纤维化进程中的中心环节,与肝癌的发生发展密切相关,但HSCs在肝癌免疫应答中的作用尚不清楚.研究发现HSCs具有很强免疫抑制活性,能够诱导胰岛移植物的免疫耐受.但HSCs的这种免疫特性与肝癌发生发展之间的关系如何呢?为此本文将通过以下三个部分进行阐述与探讨. 第一部分 小鼠肝星状细胞的分离,培养及其免疫特性的研究 目的:探索BALB/c小鼠HSCs分离,培养的方法及活化HSCs的免疫特性. 方法:经肝脏原位灌注,胶原酶消化后进行密度梯度离心获得HSCs.结合光镜下细胞的形态变化及特异性的表面标志物结蛋白和-SMA表达鉴定HSCs.同时通过混合淋巴细胞实验检测HSCs对T细胞增殖的影响及蛋白芯片检测HSCs分泌的细胞因子和趋化因子的情况. 结果:分离培养的HSCs纯度大于90%.活化的HSCs高表达desmin和-SMA,能够明显抑制T细胞的增殖并分泌多种细胞因子和趋化因子. 结论:活化后的HSCs具有免疫抑制功能,能够分泌多种生物活性物质,为后续开展HSCs免疫调节活性与肝癌之间的关系奠定基础. 第二部分 活化肝星状细胞促进肝癌的发生发展 目的:HSCs具有强大的免疫调节活性,但其免疫活性与肝癌之间的关系尚不清楚.这一部分主要研究活化的HSCs免疫抑制活性在肝癌发生发展中的作用. 方法:建立正常免疫小鼠皮下肝癌移植模型,将小鼠肝癌细胞株H22细胞单独或与HSCs联合种入小鼠皮下.注射后每2天对瘤子进行大小的测量.20天后对荷瘤小鼠行瘤组织解剖,免疫组化检测两组荷瘤小鼠肿瘤组织中Ki67,CD31与VEGF的表达.同时通过免疫组织荧光法检测T细胞和CD4+CD25+调节性T细胞浸润以及免疫抑制分子B7H1表达.TUNEL检测肿瘤组织中单个核细胞的凋亡. 结果: HSCs在体内外能够促进肝癌的生长.在小鼠肝癌模型中,共移植HSCs能够促进肿瘤的增殖,新生血管的生成以及营造局部免疫抑制微环境促进肝癌的发生发展.共移植HSCs抑制肿瘤组织中T淋巴细胞的浸润,诱导单个核细胞的凋亡并促进B7H1和调节性T细胞的表达. 结论:HSCs的免疫抑制活性能够促进肝癌发生发展,从免疫学角度阐明肝癌发生发展的机制,为肝癌的治疗提供新的靶点,靶向微环境中的基质细胞——HSCs,为肝癌的治疗提供新的思路. 第三部分 活化肝星状细胞在肝癌微环境中促进免疫抑制性细胞的表达 目的:肿瘤微环境中的免疫抑制性细胞是介导肿瘤免疫逃逸的重要因素.HSCs能够营造免疫抑制微环境,但HSCs在肿瘤微环境中与免疫抑制性细胞之间的关系尚不清楚.这一部分主要通过建立小鼠原位肝癌移植模型,研究活化的HSCs在肿瘤微环境中对免疫抑制性细胞表达的影响. 方法:利用原位注射法进行小鼠肝癌模型的建立.通过流式细胞术检测荷瘤小鼠免疫状态的变化.在体内实验中,采用原位肝癌移植瘤模型,分为H22单纯注射组与H22+HSCs联合注射组.10天后对荷瘤小鼠行瘤组织解剖测量移植瘤大小;流式细胞术检测两组荷瘤小鼠脾脏中T细胞,Treg细胞以及骨髓和脾脏中髓系来源抑制性细胞MDSCs的表达;同时免疫组化法检测两组荷瘤小鼠肿瘤组织中Treg细胞,MDSCs细胞及肿瘤相关巨噬细胞TAM的表达.在体外实验中,通过混合淋巴实验分析H22活化的HSCs 对Treg细胞增殖的影响,并通过流式细胞技术检测H22活化的HSCs对MDSCs的诱导作用. 结果:在小鼠原位肝癌模型中,小鼠肝癌细胞H22 于原位肝脏成瘤性100%,荷瘤小鼠脾脏的重量和脾脏的细胞量较正常小鼠明显增加.通过流式细胞技术检测荷瘤小鼠较正常小鼠脾脏中Treg 细胞表达增多,而且在脾脏及骨髓中MDSCs细胞的表达也明显增加. 共移植HSCs明显促进肝癌的生长.流式细胞术检测显示共移植HSCs组较单纯注射H22组脾脏中CD3/CD4+ T以及CD3/CD8+ T细胞比例明显降低,Treg细胞的比例明显升高;同时骨髓及脾脏中MDSCs细胞比例明显升高.免疫组化检测显示共移植HSCs组肝癌组织中Treg细胞,MDSCs细胞及TAM细胞明显增加.体外实验结果显示活化的HSCs能够促进Treg细胞和MDSCs细胞的表达,而肿瘤细胞H22活化后的HSCs对Treg细胞和MDSCs细胞的表达又进一步的增强. 结论:建立的小鼠原位肝癌移植模型能较好体现临床肝癌的免疫学特点.HSCs营造的免疫微环境中浸润更多的免疫抑制性细胞,它们的存在进一步促进了肿瘤的免疫逃逸,促使肝癌发生发展.我们从一个全新的角度阐释了HSCs免疫调节活性促进肝癌发生发展的机制.

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