摘要：

微生物来源次级代谢产物的结构复杂多样,活性显著,是药物研发的重要源泉.随着全基因组测序技术的进步,发现微生物基因组中通常包含20-30个次级代谢产物的生物合成基因簇,然而,在实验室常规培养条件下,往往只有少数几个基因簇对应的代谢产物被分离鉴定,其它绝大部分基因簇处于"沉默"状态,或者是即使有些基因簇处于表达状态,但其对应产物却由于产量低而被主要产物覆盖.因此,通过基因组挖掘的手段去激活和发现菌株中的其他次级代谢产物对新型药物的开发至关重要.此外,研究微生物来源天然产物的生物合成途径,将为通过组合生物合成的方法改造现有化合物以期获得活性更好的衍生物奠定基础. 本论文以来自广西北部湾涠洲岛海域的海蛞蝓的链霉菌Streptomyces globisporus SCSIO LCY12和南海深海底泥的链霉菌Streptomyces koyangensis SCSIO 5802为研究对象,运用传统的培养基优化,基因组挖掘手段和组合生物合成技术,充分挖掘其中的次级代谢产物并阐明其生物合成机制. S.globisporus SCSIO LCY12 生产芳香聚酮类化合物3,8-dihydroxy-1-methylanthraquinone-2-carboxylic acid (DMAC) (1), aloesaponarin Ⅱ (2)和globismycin A(3),其中,3是一个新骨架化合物,蕴含着新颖的生物合成机制.本论文通过体内敲除Ⅱ型聚酮合酶α亚基编码基因sgl4,确定了基因簇sgl负责主产物1,2和微量产物3的生物合成,并构建了其它22个基因的突变株,初步探讨了这些基因的功能,证明sgl11和sgl28为正调控基因.进一步,通过同位素标记实验确定了3的芳香骨架是来源于醋酸单元和甘油;通过对基因簇sgl进行异源表达,进一步确定了sgl确实负责化合物1和2的生物合成,却未能生产化合物3,但从异源表达菌株的大规模发酵液中分离鉴定了与化合物3骨架类似的globismycin B(4),从而确定了化合物3结构中与4相同的部分是由基因簇sgl负责合成,并推测菌株SCSIO LCY12基因组内sgl簇外的其他基因负责将4转化为化合物3.此外,本论文还从异源表达菌株中分离鉴定了7个芳香聚酮类化合物,分别是bhimamycin J (5),wailupemycin L(6),bhimamycin A(7),1,4,7-trihydroxy-9-methyl-anthraquinone (8),huanglongmycin A(9),RM18b (10)和1-hydroxy-6-methoxy-8-methyl-anthraquinone (11),其中化合物5是新化合物,化合物7的绝对构型由X射线单晶衍射首次确定其绝对构型.化合物1-11因结构不同发出四种不同颜色的荧光,并且表征了它们的荧光特征. 基因组测序表明S.koyangensis SCSIO 5802至少有编码21种次级代谢产物的潜能,基于基因组挖掘的策略,通过基因敲除的方法阻断了SCSIO 5802中主要代谢产物abyssomicins和candicidins的代谢通路,获得一株代谢背景简化的"双敲"突变株SCSIO 5802AC,激活了一类多环系含tetramate的大环内酰胺类化合物(PTMs)的生产,分离鉴定了化合物10-epi-HSAF (12)和含八元环的新化合物koyanamideA(13).通过体内基因敲除实验确认了负责化合物12和13生产的基因簇sko,与已经报道的PTMs基因簇进行深入地比较,推断了化合物12和13的生物合成途径,化合物12和13是以杂合的PKS/NRPS合成的含tetramate多烯为前体,在氧化还原酶的催化下形成5/5/6环和5/5/5/8环系的PTMs类化合物. 前期在菌株S.koyangensis SCSIO 5802的neoabyssomicin生物合成途径中发现了一个(Diels-Alder) DA酶AbmU,负责催化途径中的DA反应.注意到文献已报道的DA酶AbyU与AbmU催化DA反应的底物极其相似,只是链上一个甲基位置的不同.基于组合生物合成技术可产生新结构衍生物的启发,将abyU基因导入累积线性底物的突变株ΔabmU中获得ΔabmU∷abyU,对其发酵从中分离鉴定了abyssomicin 6的非对映异构体abyssomicin 7 (15).进一步,将AbyU进行体外表达纯化,酶反应和动力学表征等实验,验证了AbyU可以识别AbmU的天然底物生成15.随后又通过蛋白结构分析,对接模拟和点突变实验深入地研究了DA酶AbyU和AbmU催化同一底物发生DA反应时表现出立体选择性的不同,及其背后的催化机理. 综上所述,本论文阐明了S.globisporus SCSIO LCY12中发荧光的新骨架化合物globismycin A的芳香骨架形成过程,为后续通过组合生物合成改造和开发荧光小分子奠定了基础;激活了PTMs类化合物的生产,证明结合基因组挖掘和代谢工程可作为激活沉默基因簇表达的有力工具,为增加天然产物结构的多样性和后续的药物开发奠定基础;利用DA酶AbyU合成了新深渊霉素的衍生物,探讨了DA酶AbyU和AbmU催化同一底物发生DA反应时表现出不同的立体选择性,为分子内DA酶在天然产物手性催化中的应用提供了思路.

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