摘要：

肺癌是我国目前死亡率和发病率最高的恶性肿瘤,2015年我国新发肺癌病例约78.7万例,因肺癌死亡人数约为63.1万例.几十年来,铂类化疗是晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的唯一治疗方案,导致中位总生存期(OS)仅为8至10个月.随着表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因的发现和表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)的出现与广泛使用,使NSCLC患者的治疗效果有了较大的改善,在中国非选择性NSCLC患者中,EGFR基因突变的总发生率约为30%.但在腺癌患者中,EGFR基因总突变率可达到50%,而在非吸烟腺癌患者中,EGFR基因总突变率则能达到60%-70%.EGFR-TKIs可以阻止酪氨酸磷酸化,抑制一系列与恶性细胞的形成,增殖和凋亡相关的信号通路,从而抑制肿瘤细胞的增殖.EGFR-TKIs治疗非小细胞肺癌是目前标准的一线治疗方法,而EGFR基因突变状态是预测EGFR-TKIs疗效有效性的重要指标.目前检测EGFR基因突变的方法繁多,主要是基于肿瘤DNA为样本,应用测序和PCR技术进行检测,实现检测已知类型突变或未知的新型变异突变的目的,测序法最为经典的代表是DNA直接测序法,可检测所有已知和未知突变,被称为EGFR突变检测的"金标准",但其灵敏度较低,对样本所含肿瘤细胞数量要求较高,仅能对含量大于20%的突变基因进行检测.PCR技术最为代表的是扩增阻滞突变系统PCR(amplified refractory mutation system,ARMS,ARMS-PCR)技术,只能检测特定的突变,但对肿瘤含量较低的标本仍有较高的检出率.无论采用哪种检测方法,对实验室及人员都有较高的要求,并且检测费用昂贵.2009年EGFR突变特异性抗体(E746_A750 del与L858R)的出现,使得EGFR基因突变检测的简单化出现了可能性.近几年,针对突变特异性抗体的应用,如抗体的稀释浓度,检测平台,检测结果等研究已十分广泛,与分子检测EGFR基因突变的结果一致性也有比较深入的研究,但不同的研究,其敏感性和特异性有较大的差异,灵敏度30%-100%,特异度都在90%左右,抗体的表达水平与临床用药的关系评价,不同的研究结果差异较大,甚至相反.关于EGFR突变特异性抗体的研究,大部分的都基于手术切除标本或组织微阵列(TMA),很少有基于手术切除标本,活检标本,细胞学标本等标本类型的综合研究.为进一步确认利用EGFR突变特异性抗体检测肺腺癌的EGFR基因突变的价值,以及EGFR突变特异性抗体的表达水平与临床用药的关系,本研究采用ARMS-PCR检测肺腺癌EGFR基因突变状态和突变特异性抗体免疫组织化学法检测肺腺癌EGFR突变特异性抗体表达水平,分析ARMS-PCR和免疫组织化学方法检测EGFR突变状态的一致性以及EGFR突变特异性抗体表达水平与临床用药的关系,综合评价EGFR突变特异性抗体在肺腺癌中的应用价值.材料与方法1.采用ARMS-PCR检测154例肺腺癌样本,包括61例手术切除标本,75例活检标本,18例胸水沉渣石蜡包埋标本(细胞学标本)EGFR基因突变状态以及两种EGFR突变特异性抗体E746_A750 del与L858R的表达情况.2.统计学处理:应用SPSS21.0软件包进行数据分析,计数资料的比较采用χ2检验或Fisher确切概率法.采用单因素和多因素cox回归分析定量分析突变特异性抗体与NSCLC患者临床预后的关系,以p0.05为差异有显著性.结果1.手术切除标本使用ARMS-PCR检测EGFR19外显子缺失和L858R的突变率分别为44.3%,41.0%;活检标本使用ARMS-PCR检测EGFR19外显子缺失和L858R的突变率分别为48.0%,41.3%;细胞学标本使用ARMS-PCR检测EGFR19外显子缺失和L858R的突变率分别为38.9%,27.8%,三种标本类型的检测结果差异无统计学意义(P0.05).2.采用≥1+作为免疫组化阳性判读标准时,E746_A750突变抗体在手术切除标本,活检标本,细胞学标本诊断EGFR基因19号外显子缺失突变的灵敏度分别为 55.6%,97.1%,61.1%,特异度分别为 94.9%,42.9%,100.0%,三种组织类型之间的差异无统计学意义(P0.05).L858R突变抗体在手术切除标本,活检标本,细胞学标本诊断EGFR基因21号外显子L858R突变的灵敏度分别为72.0%,100.0%,67.7%,特异度分别为 97.7%,40.0%,100.0%,三种组织类型之间的差异无统计学意义(P0.05).3.采用≥2+作为阳性标准时,E746_A750突变抗体在术切除标本,活检标本,细胞学标本诊断EGFR基因19号外显子缺失突变的灵敏度分别为29.6%,100.0%,38.9%,特异度分别为97.4%,42.9%,100.0%,三种组织类型之间的差异无统计学意义(P0.05).L858R突变抗体在手术切除标本,活检标本,细胞学标本诊断EGFR基因21号外显子L858R突变的灵敏度分别为44.0%,100.0%,38.7%,特异性分别为100.0%,100.0%,100.0%,三种组织类型之间的差异无统计学意义(P0.05).4.采用3+作为阳性标准时,E746_A750突变抗体在术切除标本,活检标本,细胞学标本诊断EGFR基因19号外显子缺失突变的灵敏度分别为14.8%,100.0%,22.2%,特异度分别为100.0%,14.3%,100.0%,三种组织类型之间的差异无统计学意义(P0.05).L858R突变抗体在手术切除标本,活检标本,细胞学标本诊断EGFR基因21号外显子L858R突变的灵敏度分别为20.0%,100.0%,22.6%,特异性分别为100.0%,100.0%,100.0%,三种组织类型之间的差异无统计学意义(P0.05).5.E746_A750突变抗体表达水平与性别,年龄,是否吸烟,肿瘤大小,淋巴结转移有无,胸膜是否侵犯无关(P0.05).该抗体多表达于组织学以腺泡或贴壁为主的肺腺癌中,几乎不表达于组织学以乳头,微乳头以及实体为主的肺腺癌中,差异有统计学意义(P0.05).6.L858R突变抗体的表达水平与性别,年龄,是否吸烟,肿瘤大小,淋巴结转移有无,胸膜是否侵犯无关(P0.05).该抗体多表达于组织学以腺泡或贴壁为主的肺腺癌中,几乎不表达于组织学以乳头,微乳头以及实体为主的肺腺癌中,差异有统计学意义(P0.05).7.服用吉非替尼的中位PFS和OS的差异与性别,年龄,是否吸烟,肿瘤大小,是否有远处转移,突变特异性抗体的表达水平无关(P0.05).结论1.EGFR突变特异性抗体与肺腺癌的性别,年龄,是否吸烟,肿瘤的TNM分期无关,与肿瘤的组织学类型有关,在腺泡或者贴壁类型中高表达,在乳头,微乳头,实体型肿瘤中低表达.2.免疫组化结果定义3+为阳性时,与分子检测EGFR基因突变结果的一致性为100%,可以作为一种快速,廉价,准确的EGFR基因突变检测方法.3.EGFR突变特异性抗体的表达水平与服用吉非替尼的中位PFS和OS无相关性.

展开