摘要：

目的:内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,e NOS,NOS3)是一氧化氮合酶家族成员之一,是参与细胞内一氧化氮生成的催化酶.近几年的研究结果证实了NOS3在乳腺癌,肠癌,胰腺癌及前列腺癌中参与促进血管生成,肿瘤细胞增殖和侵袭,抑制免疫反应和肿瘤细胞凋亡等.但是,目前关于NOS3在恶性肿瘤中表达情况的研究仍然较少,并且其影响肿瘤发生发展的机制研究还不全面,有待深入挖掘.胃癌是目前最常见的恶性肿瘤之一.在我国,多数胃癌患者在诊断时已经是进展期,虽然以胃癌根治切除术为核心的治疗方案一定程度上改善了患者的预后,但仍有约1/3的胃癌患者手术后复发.在胃癌中,腹膜播散几乎占胃癌复发的50%,发生腹膜转移的胃癌患者的中位生存时间只有7-16个月.因此,进一步探索预防和治疗胃癌腹膜转移的诊疗方案对改善胃癌患者的预后,延长生存时间具有重要的意义.NOS3作为胃癌患者预后标志物及其作为胃癌腹膜转移治疗靶点的价值还没有研究报道.蟾毒灵提取自常见的中药蟾酥,是其有效成分之一,作为华蟾素的主要有效成分,蟾毒灵被广泛用于治疗多种恶性肿瘤.蟾毒灵可以促进多种肿瘤细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞的增殖,侵袭和其他恶性生物学过程.然而,蟾毒灵对胃癌腹膜转移的作用并且NOS3在此过程中扮演的角色还不清楚.研究方法:1.从UCSC Xena,GEO数据库和CCLE数据库下载肿瘤组织,正常组织及人类癌细胞系中NOS3 mRNA表达数据和肿瘤患者的表型数据;2.分别比较肿瘤组织,正常组织及癌细胞系中NOS3 mRNA的表达水平;3.t-检验比较各肿瘤类型中肿瘤组织和正常组织的NOS3表达水平;4.t-检验比较各肿瘤类型中早期肿瘤和晚期肿瘤的NOS3表达水平;5.Kaplan-Meier,Log-rank和COX回归分析检验各肿瘤类型中NOS3表达与患者预后之间的关系;6.免疫组化实验检测收集的90例胃癌患者病历组织中NOS3表达水平,并分析其与患者临床数据和生存之间的关系;7.使用siRNA或NOS3抑制剂(L-NAME)干预胃癌细胞中NOS3的表达,或者使用蟾毒灵处理胃癌细胞;8.MTT实验检测胃癌细胞的增殖能力;9.粘附实验检测胃癌细胞粘附于基质胶的能力;10.伤口愈合实验和Transwell实验检测胃癌细胞的侵袭和迁移能力;11.Western blot实验检测胃癌细胞中NOS3,p-NOS3(Ser-1177),EMT过程关键蛋白,MAPK通路关键蛋白的表达;12.使用MKN-45P细胞构建胃癌腹膜转移裸鼠模型,统计终止实验时裸鼠的腹膜转移瘤数量和质量,腹水体积,免疫组化实验检测NOS3,E-钙粘蛋白和波形蛋白的表达情况.结果:第一部分:基于泛癌症分析研究NOS3在胃癌中的表达及临床意义.1.1 NOS3 mRNA在各种肿瘤类型中的表达水平是不同的,其中在胃癌组织中的表达水平最高;1.2 NOS3 mRNA表达水平位列前三名的细胞系为在胃腺癌,结肠腺癌以及神经系统肿瘤组织的细胞系;1.3 NOS3 mRNA在直肠腺癌,胃腺癌,胰腺癌,卵巢浆液性囊性腺癌,皮肤黑色素瘤和头颈部鳞状细胞癌中表达水平显著高于正常组织;1.4皮肤黑色素瘤中,NOS3在分期较晚的患者中表达更高.胃腺癌中,NOS3表达与肿瘤分期之间未显示出显著的关联;1.5 NOS3 mRNA表达水平较高的胃癌患者总生存时间显著缩短;1.6综合TCGA-STAD和GSE29272数据集分析,发现NOS3是胃癌患者预后的独立危险因素;1.7免疫组化实验检测我们收集的90例胃癌患者病理组织发现NOS3是胃癌患者预后的独立危险因素.第二部分:NOS3在胃癌腹膜转移过程中的作用及机制.2.1选择胃癌细胞系MGC-803和胃癌腹膜高转移细胞系MKN-45P进行细胞实验,使用siRNA敲低NOS3表达后,胃癌细胞黏附,侵袭和迁移能力显著降低,EMT过程被逆转;2.2 L-NAME抑制NOS3表达后,胃癌细胞黏附,侵袭和迁移能力显著降低,EMT过程被逆转;2.3生物信息学分析发现胃癌中NOS3可能通过MAPK通路调控胃癌的恶性生物学行为;2.4胃癌细胞中干预NOS3表达后,ERK和p38的磷酸化水平显著降低,MAPK通路活化被抑制.第三部分:蟾毒灵抑制NOS3活性对胃癌腹膜转移的影响.3.1蟾毒灵通过与NOS3蛋白结合降低其磷酸化(Ser1177)水平;3.2蟾毒灵处理胃癌细胞MGC-803和胃癌腹膜高转移细胞系MKN-45P后,胃癌细胞的黏附,侵袭和迁移能力被明显抑制,EMT过程被逆转;3.3使用胃癌腹膜高转移细胞系MKN-45P构建胃癌腹膜转移裸鼠模型,结果发现实验组(蟾毒灵单药,L-NAME单药和双药组)裸鼠的腹膜转移瘤数量,质量和腹水体积明显减少;3.4实验组裸鼠腹膜转移瘤中NOS3蛋白表达降低,E-钙粘蛋白表达增多而波形蛋白表达降低.结论:通过分析公共数据集以及收集的胃癌患者病理组织,我们证实了NOS3的高表达与胃癌患者的预后不良有关,NOS3是胃癌患者预后的独立危险因素.NOS3通过MAPK信号通路调控胃癌细胞的侵袭,迁移和定植能力以及EMT过程.NOS3可能通过MAPK通路正向调节胃癌的腹膜转移过程,导致胃癌患者的不良预后.Ser1177磷酸化是NOS3的主要活性形式之一,通过筛选发现蟾毒灵是以NOS3为靶标的临床治疗药物,它可以降低NOS3的磷酸化水平来抑制NOS3的活性.蟾毒灵可通过抑制NOS3-MAPK信号通路阻止胃癌腹膜转移的进程.这些结果提示我们NOS3可能是胃癌患者预测总生存时间的生物标志物,并且是胃癌治疗的潜在靶点.蟾毒灵可能通过抑制NOS3活性,下调MAPK通路的活化,进而抑制胃癌的腹膜转移进程.本研究为蟾毒灵腹腔内灌注治疗胃癌腹膜转移提供了更多的证据支持.

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