摘要：

本文主要从以下几方面进行论述: 第一部分 分泌型AGR2明显增强结直肠癌细胞的迁移与侵袭能力 目的: 探究AGR2表达量对结直肠癌病人预后的评估价值和分泌型AGR2对结直肠癌细胞迁移与侵袭能力的影响. 方法: 利用GEO数据库,借助Kaplan-Meier方法分析AGR2的表达量与结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)患者预后的关系(预后指标采用整体生存期-Overall survival time,OS;疾病相关生存期-Disease-specificsurvival time,DSS;无病生存期-Disease-free survival,DFS).利用Western blot方法检测CRC组织标本中AGR2的表达情况(包括癌组织和癌旁组织).利用Western blot和半定量PCR(semi-quantitative RT-PCR)方法检测人7种CRC细胞系(包括:SW48,SW480,LoVo,Caco-2,HCT116,HT29,DLD-1)中AGR2的表达情况.采用CRISPR/Cas9基因敲除技术在HT29细胞系中对内源性AGR2进行基因敲除(Knock-out)得到HT29KO(HT29AGR2-KO)的细胞系与相应对照HT29WT(HT29wild-type).购买人重组AGR2蛋白(Recombinant Human AGR2,rAGR2)代替分泌型AGR2进行后续实验.利用划痕实验(Wound-healing assay)与Transwell小室的共培养体系检测分泌型AGR2对CRC细胞迁移能力的影响.收集HT29WT和HT29KO细胞的条件性培养基(conditional medium,CM),提取蛋白后经Western blot方法检测AGR2蛋白的水平,然后将来源于HT29WT细胞的CM与HT29KO细胞共培养后利用Transwell方法检测HT29WT细胞分泌的AGR2蛋白对HT29KO细胞迁移能力的影响.体内实验采用裸鼠尾静脉注射CRC细胞构建结直肠癌的肺转移模型.检测指标包括体重及肺脏内CRC转移灶的数目和大小. 结果: 1.AGR2的高表达提示CRC患者预后不佳. 2.AGR2在CRC癌组织中的表达量要明显高于癌旁组织. 3.AGR2在不同CRC细胞系的表达中有明显的差异.其中在HT29,Caco-2等细胞中表达较高,而在SW48与LoVo等细胞系中几乎不表达. 4.分泌型AGR2在体外可明显增强CRC细胞的迁移能力. 5.CRC细胞内源性AGR2表达过高会降低细胞对分泌型AGR2的反应. 6.分泌型AGR2在体内可明显增加CRC细胞的侵袭能力. 第二部分 分泌型AGR2抑制经典Wnt/β-catenin信号通路 目的: 探究分泌型AGR2与经典Wnt/β-catenin信号通路的关系. 方法: 利用Western blot方法检测HT29KO与HT29WT细胞中β-catenin和Axin2蛋白的水平以反映AGR2的内源性敲除对经典Wnt/β-catenin信号通路的影响.利用rAGR2处理SW48和HT29KO细胞后检测分泌型AGR2对β-catenin和Axin2蛋白的影响.构建AGR2的真核表达质粒(pcDNA-AGR2)与敲减质粒(shAGR2),转染HEK293T细胞后检测β-catenin和Axin2蛋白水平的变化;利用rAGR2处理HEK293T细胞(作用时间梯度和rAGR2的浓度梯度)后检测β-catenin和Axin2蛋白水平的改变.同时利用荧光实时定量PCR(qPCR)在以上实验分组中均检测经典Wnt/β-catenin信号通路一些标志分子的mRNA水平的变化(包括β-catenin,Axin2,TCF4).HEK293T细胞经rAGR2处理或过表达AGR2后利用Top/Fop-Flash双荧光素酶报告基因实验或细胞核质蛋白分离技术验证AGR2对经典Wnt/β-catenin信号通路的作用. 结果: 1.分泌型AGR2在CRC细胞中并不能激活经典Wnt/β-catenin信号通路. 2.分泌型AGR2在HEK293T细胞中能降低β-catenin,Axin2和TCF4的表达. 3.分泌型AGR2在HEK293T细胞中能够抑制经典Wnt/β-catenin信号通路的转导活性. 4.分泌型AGR2能促进β-catenin蛋白的降解,且不依赖于GSK-3β的活性. 第三部分 分泌型AGR2通过上调Wnt11的表达激活非经典的Wnt信号通路 目的: 继续探究分泌型AGR2促进CRC细胞转移与侵袭能力的机制. 方法: 利用rAGR2处理HEK293T细胞,借助qPCR方法检测分泌型AGR2对Wnt配体蛋白的作用.利用rAGR2处理HEK293T细胞(作用时间梯度和rAGR2的浓度梯度)后,借助Western Blot方法检测分泌型AGR2对非经典Wnt信号通路中的关键蛋白c-jun氨基末端激酶(c-jun amino-terminal kinase,JNK)与钙调素依赖型蛋白激酶Ⅱ(Calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)的影响.在rAGR2处理HEK293T细胞的同时转染Wnt11-siRNAs下调Wnt11的表达,检测分泌型AGR2对非经典Wnt信号通路激活是否依赖Wnt11.通过CaMKⅡ的特异性抑制剂KN93抑制分泌型AGR2对CaMKⅡ的激活,检测分泌型AGR2对经典Wnt/β-catenin信号通路的抑制是否依赖CaMKⅡ的活性.在rAGR2处理CRC细胞的同时转染Wnt11-siRNAs下调Wnt11的表达,检测分泌型AGR2促进CRC细胞的转移与侵袭能力是否依赖于Wnt11.利用CaMKⅡ与JNK的抑制剂KN93与SP600125处理CRC细胞,借助划痕实验和Transwell实验检测分泌型AGR2促进CRC细胞的侵袭能力是否依赖于非经典Wnt信号通路的激活. 结果: 1.分泌型AGR2能上调Wnt11的表达并激活非经典Wnt信号通路. 2.分泌型AGR2主要通过激活CaMKII抑制经典Wnt/β-catenin信号通路. 3.分泌型AGR2在CRC细胞主要通过上调Wnt11来激活非经典Wnt信号通路. 4.分泌型AGR2通过Wnt11介导的非经典Wnt信号通路促进CRC细胞的迁移与侵袭.

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