摘要：

附子是毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根加工品,被誉为"回阳救逆第一品药",在中医临床有着重要地位.化学成分是附子发挥药效的物质基础.长期以来,对附子的化学成分研究多集中于生物碱,对其余成分研究较少.附子多糖也是附子重要的一类药效成分,具有抗肿瘤,促进免疫应答,保护血管等作用,无安全性风险.然而,多糖类成分结构易受炮制加工条件的影响而改变,进而引起活性变化.生附片是由泥附子切片后热风干燥而成,保留了泥附子大部分的化学成分,散寒止痛作用强,解析生附片多糖的结构与药理活性有助于阐明生附片的物质基础.因此,本课题围绕生附片多糖的提取纯化,结构表征,生物活性等开展研究,揭示生附片多糖的理化性质与抗炎抗肿瘤活性,以期为炮制工艺对附子多糖的影响规律研究奠定基础.本文的主要研究内容与结果如下:1.生附片多糖的提取工艺与理化性质研究通过对生附片多糖理化性质的测定可以初步认识其组成与基本属性.以料液比,提取时间,提取次数为指标,通过单因素实验,确定生附片多糖的最佳提取工艺为:料液比为1:20,回流提取2次,每次150 min,粗多糖提取率为6.47%.对多糖含量,蛋白质含量,糖醛酸含量进行检测,发现生附片多糖由65.89%葡萄糖,4.58%糖醛酸组成,不含蛋白质.对生附片多糖的颜色,黏度,溶解度,吸湿性等性质进行表征,结果表明生附片多糖是黏度为2.05 cp,溶解度为83.25%,吸湿性较强的棕色多糖.2.生附片多糖的结构表征研究多糖是一种结构复杂的活性生物大分子,其结构和活性有着密切联系,对多糖的结构表征可为其构效关系分析提供依据.为研究生附片多糖的结构特征与形态,采用DE-52纤维素柱和葡聚糖凝胶G-100柱对生附片粗多糖进行分离纯化,从中可分离出1种中性多糖,2种酸性蛋白多糖,其中中性多糖为主要成分.对生附片中性多糖的物质组成,特征官能团,分子量,单糖组成,分子量,三螺旋结构,表面形态进行表征.结果显示,生附片多糖未结合蛋白质与核酸,具有糖类的特征官能团α构型和β构型糖苷键,并且含有吡喃环.色谱研究结果显示,多糖的分子量为8.0251×104 Da,由阿拉伯糖,半乳糖,葡萄糖和果糖以摩尔比0.004:0.018:0.913:0.065组成.刚果红实验结果表明,多糖具有三螺旋结构.扫描电子显微镜结果表明,多糖为表面附着薄片且呈层状堆积的多块状结构.3.生附片多糖体外免疫调节及抗炎活性评价生附片中性多糖是生附片多糖的主要片段,本课题重点研究其体外免疫调节活性及抗炎活性.研究发现,生附片中性多糖在25～400μg·m L-1剂量范围内对巨噬细胞没有细胞毒性.生附片中性多糖对巨噬细胞吞噬功能有一定促进作用(p<0.05),可增加巨噬细胞NO生成量(p<0.01),发挥免疫调节作用.Western Blot结果显示,生附片中性多糖能够增加巨噬细胞内TLR4,NF-κB蛋白表达(p<0.05),表明其免疫调节作用与激活TLR4/NF-κB通路有关.此外,生附片多糖能够抑制脂多糖诱导炎性巨噬细胞的吞噬作用与炎症介质NO及IL-6释放(p<0.01),说明生附片中性多糖具有一定的抗炎活性.流式细胞结果显示,生附片中性多糖能够降低脂多糖诱导的炎性巨噬细胞CD86表达(p<0.01),表明其抗炎活性主要通过抑制巨噬细胞M1极化而实现.生附片多糖具有显著的体外抗炎活性与一定的免疫调节活性,可能是附子"抗炎镇痛"的重要物质基础.4.生附片多糖体内抗肿瘤作用研究在细胞实验基础上,本课题进一步研究生附片多糖联合化疗药物环磷酰胺对H22荷瘤小鼠的抗肿瘤作用.结果表明,单独使用环磷酰胺以及联合低,高剂量生附片多糖的抑瘤率分别为46.70%,53.01%,64.08%,说明生附片多糖可以提高环磷酰胺的抑瘤率.此外,生附片多糖还能增加环磷酰胺引起的肿瘤细胞凋亡,减少细胞因子TNF-α与IL-10水平(p<0.05),说明生附片多糖能够增强环磷酰胺的抗肿瘤作用.与模型组相比,环磷酰胺治疗会出现免疫器官损伤,炎症因子水平降低等免疫抑制现象,但是联合生附片多糖给药后,小鼠脾脏指数增加(p<0.01),脾淋巴细胞转化率增高(p<0.05),炎症因子IL-1β与IL-6水平升高(p<0.01),说明生附片多糖能够减轻环磷酰胺所致的免疫抑制毒性.以上实验结果说明生附片多糖与环磷酰胺联合用药可达到"增效减毒"的效果,有望作为肿瘤治疗的辅助药物.综上所述,本课题研究了生附片多糖的理化性质与结构特征,探索了生附片多糖的体外抗炎活性和体内抗肿瘤活性,阐明了生附片多糖可能是附子发挥"抗炎镇痛"功效的物质基础,为后续研究炮制工艺对附子多糖的影响奠定了基础,为附子多糖的临床应用与产品开发提供了科学依据.

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