摘要：

研究背景与目的: 在当前的临床治疗实践中,修复因外伤,肿瘤和感染导致的骨骼缺损成为了一个巨大的挑战.虽然骨移植历来被认为是金标准,但它仍然面临着如免疫排斥和有限的供体来源等挑战.因此,骨组织工程技术已经崭露头角,成为推动骨缺损愈合的关键途径之一,并为解决这一复杂问题提供了全新的解决方案.近年来随着打印技术的快速发展,3D打印(Three-dimensional printing)技术不仅可以通过数字化可控的打印设备打印出高表面积,高孔隙率,高机械强度的三维立体支架,还可以构建与缺损部位完美匹配的高精度高可塑性材料模型,使其更适合骨修复细胞的粘附和生长,促进组织形成过程中的营养物质交换,从而加速骨缺损部位的修复. 另外,大尺寸骨缺损修复过程中早期血管化网络重建的问题仍然是限制骨愈合的关键因素之一.近年来,一种新型治疗肾病性贫血药物罗沙司他(Roxadustat,RD)被证明能够有利促进骨愈合过程中血管网络的构建.RD是一种可口服的强效低氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor,HIF)脯氨酰羟化酶(Prolyl hydroxylase,PHD)抑制剂(HIF-PHI),可以在氧含量正常的环境中稳定HIF-1α的表达,从而激活下游包括促红细胞素在内的多种与血管生成相关蛋白的表达.同时RD还可降低铁调素进行铁动员从而诱导红细胞的生成,通过增加内源性促红细胞生成素和降低铁调素改善铁代谢来促进血管形成的效果. 众多的科学研究已经证实温和热疗(40-43℃)对骨缺损的愈合大有裨益,温和的光热刺激能够显著地促进BMSCs的骨化分化和成骨细胞的活动,进而实现促进骨骼修复的目的.通过热应激诱导导热休克蛋白(Heat Shock Proteins,HSPs)的表达增加,温和热疗能够进一步激活与成骨相关的通路.在808nm近红外光的协助下,通过介孔聚多巴胺(Mesoporous polydopamine,MPDA)理想的光热转换性能,可实现高效且精准的温和热疗以增强成骨细胞的成骨活动. 综上,本研究制备了一种载罗沙司他的介孔聚多巴胺3D打印甲基丙烯酰化明胶(Gel MA/HA/MPDA@RD,GHM@RD)水凝胶支架,具有主动诱导骨缺损区域内部血管网络构建功能的同时能够通过高效精准的温和热疗协同促进成骨活动,加速骨缺损愈合. 研究方法: 1.GelMA/HA/MPDA@RD水凝胶生物墨水的制备. 2.材料的表征:MPDA纳米粒子TEM,SEM等表征,Gel MA/HA/MPDA@RD支架的机械性能,降解率,溶胀率及流变等性能的检测. 3.体外实验: 成骨性能评价:CCK-8,活死染色,细胞骨架荧光染色,碱性磷酸酶染色及定量,茜素红染色及定量,成骨相关蛋白免疫荧光染色及半定量,q RT-PCR,western blot和转录组测序学等实验研究支架材料的生物相容性,促进BMSCs增殖和成骨分化的能力及其相关机制. 成血管性能方评价:CCK-8,划痕实验,细胞迁移实验,小管形成实验,成血管蛋白免疫荧光染色及半定量,q RT-PCR,western blot和转录组学测序等实验研究支架材料促进血管生成的能力及其相关机制. 4.体内实验:制备大鼠颅骨缺损模型以验证生物材料的促进骨愈合的潜能. 实验结果: 1.通过3D打印技术成功制备出负载罗沙司他的介孔聚多巴胺的Gel MA水凝胶支架(Gel MA/HA/MPDA@RD).Gel MA/HA/MPDA@RD支架具均匀的孔隙率,良好的降解率,溶胀率,流变性能和机械强度.同时该支架在体外经过808nm近红外光照射后能迅速升温,具有优异的光热转化性能. 2.Gel MA/HA/MPDA@RD支架在体外经过808nm近红外照射后达到的温和热疗作用可以促进骨髓间充质干细胞的增殖以及成骨相关基因(ALP, RUNX2,COL-1,OCN)和蛋白(BMP-2,RUNX2,COL-1,OCN)的表达,具有优秀的体外成骨能力. 3.Gel MA/HA/MPDA@RD支架在体外经过808nm近红外照射后达到的温和热疗作用可以促进人脐静脉内皮细胞的迁移,体外成小管以及成血管相关基因(HIF-1α,VEGF,PDGF,α-SMA)和蛋白(HIF-1α,VEGF,CD31)的表达,具有优秀的体外成血管能力. 4.体内通过Micro-CT,H&E,Masson染色等方式对体内骨愈合及血管网络构建情况进行评估.动物实验表明Gel MA/HA/MPDA@RD支架可以通过定期的NIR照射实现温和热疗,从而有效促进骨缺损的愈合. 结论: 在本研究中,基于大段缺损骨组织再生过程中对早期血管网络重建的需求,我们成功将负载了载RD的MPDA纳米微球和纳米羟基磷灰石的Gel MA水凝胶墨水打印成具有互连的微通道网络结构的Gel MA/HA/MPDA@RD(GHM@RD)水凝胶支架.在血运重建方面,GHM@RD支架通过缓释RD激活血管生成相关的HIF-1α信号通路,从而增加其下游血管生成相关蛋白的表达,在常氧环境下诱导了血管新生.在骨再生方面,MPDA纳米粒子不仅可以通过表面的多酚基团促进骨祖细胞的附着和增殖,还通过其理想的光热转换特性实现了稳定的温和热疗.808nm近红外光照射引起的温和热刺激可以通过PI3K/AKT信号通路并增强Hsp90的表达从而促进骨再生.

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