摘要：

研究背景: 缺血性心脏病严重威胁着人类的健康.由于溶栓,经皮冠状动脉成形术等治疗措施的广泛应用,使得缺血心肌能及时有效的恢复血供,可使缺血性心脏病患者的死亡率大为减少.但随之而来的心肌缺血再灌注损伤,不仅影响血运再通的疗效,甚至可导致死亡.心肌缺血再灌注损伤的机制复杂,心肌细胞凋亡因其可逆性而在心肌缺血再灌注损伤中具有重要的地位. 硫氧还蛋白(Trx)是一种广泛分布的控制细胞还原/氧化状态和细胞增殖/生存的小分子蛋白质,它与多种心血管疾病都有密切的关系,它除了基本的氧化还原调节功能外,还具有多种生物学活性,如抗炎,抗细胞凋亡等.研究发现,Trx可直接与凋亡信号调节激酶1(ASK1)结合而抑制其活性;也可通过清除活性氧,与线粒体基质中的CtyC形成复合物而抑制凋亡信号的传递,从而间接抑制凋亡;还可通过硝基化修饰,亚硝基化修饰这种蛋白翻译后修饰的方式调节硫氧还蛋白对细胞凋亡的调控.然而,其凋亡的抑制机制仍未完全阐明. 研究发现,Trx的氧化还原调节功能是通过其活性中心位点Cys32-Gly-Pro-Cys35(CGPC)中的二硫键和巯基的互变来实现的.人Trx的结构除具有CGPC活性中心外,还含有3个Cys残基(Cys62,69,73)及1个Tyr-49残基.它们在Trx的结构和功能中发挥巨大作用.研究发现,Tyr49发生硝基化修饰后,Trx的抗凋亡作用减弱; Cys-69被亚硝基化修饰后,Trx的抗凋亡能力得到增强;Cys62可介导Cys69,73的亚硝基化修饰;Cys73亚硝基化修饰后可通过转亚硝基作用于caspase3,抑制细胞凋亡.但也有学者发现,Trx在高浓度的S-亚硝基化谷胱甘肽(如1 mmol/L)作用下,可能导致包括催化中心在内的其他Cys的亚硝基化,甚至干扰Trx与ASK1的结合,而诱导细胞凋亡.因此推测不同的半胱氨酸残基对亚硝基化修饰的敏感度不同,而不同位点的硝基化,亚硝基化状态可能对Trx发挥不同的调节作用.进一步阐明硝基化,亚硝基化修饰对Trx结构和功能的影响及其调节凋亡保护心肌的机制,将为Trx应用于临床预防和治疗心肌缺血再灌注损伤有重要的意义. 实验目的: 1.获得正确的pET-45b-hTrx,hTrx C32S,hTrx Y49F和hTrx C69S载体,表达出相应具有生物学活性的蛋白. 2.观察hTrx,hTrx C32S,hTrx Y49F和hTrx C69S突变体及分别给予硝基,亚硝基化修饰后对小鼠心肌缺血再灌注损伤中心肌细胞凋亡,心肌梗死面积的影响. 3.获得正确的"rAd-ASK1"腺病毒包装质粒. 实验方法: 1.应用RT-PCR方法获得hTrx全长cDNA,将DNA片段和空载体pET-45b进行酶切连接,采用环状定点诱变方法对hTrx基因进行定点突变,获得正确的pET-45b-hTrx,hTrx C32S,hTrx Y49F和hTrx C69S载体,分别进行转化,诱导表达.经 Ni-NTA柱纯化,内毒素亲和柱去除内毒素后获得具有生物学活性的野生型和突变型hTrx蛋白. 2.制备小鼠缺血再灌注模型,分别用PBS,hTrx,硝基,亚硝基C32S hTrx,亚硝基C69S hTrx,硝基Y49F hTrx干预,再灌注3 h,分别检测心肌细胞凋亡(TUNEL染色)和Caspase-3活性.再灌注24 h后,测定心肌梗死范围(伊文氏蓝-TTC染色). 3.应用基因克隆及重组技术,将 ASK1基因的CDS区分段构建至穿梭载体pYr-ads-1-FLAG-N上. 实验结果: 1.成功构建了野生型hTrx,及C32S,C69S和Y49F突变体的载体质粒,其所诱导表达的蛋白具有活性,符合下一步实验需求. 2.建立小鼠缺血再灌注模型,分别腹腔注射不同剂量的重组hTrx,C32S,C69S和Y49F蛋白,观察到:(1)C32S突变体降低MIRI导致的细胞凋亡和心梗范围的作用较野生型弱;硝基化修饰后其上述作用减弱;而亚硝基化修饰后其上述作用增强;(2)Y49F突变体对MIRI导致的细胞凋亡和心梗范围保护作用较野生型hTrx无显著性差异,硝基化修饰不能增加其细胞凋亡数目和心梗范围面积;(3)C69S突变体对MIRI导致的细胞凋亡和心梗范围保护作用较野生型hTrx无显著性差异,但亚硝基化修饰不能增强其保护作用. 3.获得了正确的"rAd-ASK1"腺病毒. 结论: 1.本研究构建了野生型hTrx,及C32S,C69S和Y49F突变体的载体,经原核表达,纯化,去除内毒素获得相应具有生物活性的蛋白. 2.进一步研究表明,hTrx的Cys-32,69和Tyr-49可以通过构型改变影响hTrx的抗凋亡作用;半胱氨酸残基和酪氨酸残基的亚硝基和硝基化修饰可改变其抗凋亡能力.

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