摘要：

目的:胰腺癌是一种恶性程度极高,迁移能力强,侵袭水平高,且预后很差的消化系统恶性肿瘤.对于在临床上遇到的怀疑是胰腺癌的患者,如想要对其病情进行早期诊治,并及时干预以防止其恶化,重点就在于要对其开展肿瘤标志物的检测.而现如今,胰腺癌发生的病理生理机制还没有得到完全揭示.本文通过探究SERPINA1在人胰腺导管腺癌的组织层面和人胰腺癌的细胞层面内的差异表达水平,并在将其敲减后,进行胰腺癌细胞的诸多表型实验,观察其表达水平的下降对包括细胞增殖能力,迁移水平,凋亡变化,周期分布等所产生的影响,以期验证SERPINA1在胰腺癌的发展过程中具体通过什么样的机制,起到了哪些作用.为胰腺癌的早期诊断或治疗干预提供一种新的分子标志物.方法:本研究采用了多种方法,包括收集31例胰腺导管腺癌患者的临床病理标本,使用免疫组织化学染色(IHC)技术检测SERPINA1基因在癌组织和癌旁组织中的差异表达情况.应用细胞免疫荧光染色法检测SERPINA1指标在胰腺癌细胞中的表达位置.通过qRT-PCR和Western blot技术,我们可以检测人正常胰腺细胞系和四种胰腺癌细胞系中SERPINA1在mRNA表达水平以及蛋白层面的表达情况.后利用三种不同序列的si RNA和BxPC-3,PANC-1,SW1990细胞系,构建出敲减SERPINA1的胰腺癌细胞株.通过qRT-PCR和Western blot技术,我们可以有效地评估敲减效率.之后进行胰腺癌细胞生物学行为的多种表型实验,包括在验证癌细胞的增殖水平上使用了CCK-8配合酶标仪检测,Ed U荧光照相计算比率和中皿内克隆形成拍照的方法进行反复评估.在对胰腺癌细胞的转移水平检测方面,进行了六孔板内的划痕愈合试验拍照,不铺基质胶的Transwell转移小室拍照.使用铺基质胶的Transwell实验观察癌细胞的侵袭能力.流式细胞术分别观察凋亡水平及周期在SERPINA1被敲低时有什么相应改变.最后通过Western blot这一经典的免疫蛋白印记实验,来观察敲减SERPINA1后BxPC-3,PANC-1,SW1990三种胰腺癌细胞系中的一些关键蛋白变化是否与前述的细胞功能实验结果相符.并选取经典研究通路MAPK,观察SERPINA1是否有可能通过该通路发挥作用.结果:1.在收集的31例人胰腺导管腺癌组织标本中,SERPINA1在癌组织切片中的着色清晰,癌结构典型,其表达水平与对应的癌旁组织相比显著增高.2.SERPINA1在人胰腺癌细胞BxPC-3,Capan-2,PANC-1,SW1990中的细胞核及细胞质内都存在表达.3.SERPINA1在人胰腺癌细胞mRNA和蛋白水平上的表达水平显著高于正常人胰腺细胞系HPDE6-C7,这一结果在人胰腺癌细胞PANC-1,BxPC-3,SW1990和Capan-2中得到了证实.4.使用的三种si RNA可以将BxPC-3,PANC-1,SW1990细胞系中SERPINA1的表达水平显著敲低,表现在敲减SERPINA1后,相对于对照组Si-SERPINA1的mRNA和蛋白层面的表达被显著抑制.5.敲减SERPINA1的BxPC-3,PANC-1,SW1990细胞系,相比于非敲减组,增殖水平下降,迁移速率减慢,侵袭能力下降,周期分布变化,凋亡率增加,差异具有统计学意义.6.敲减SERPINA1后,在BxPC-3,PANC-1中,G0/G1期增加,S期减少;但是在SW1990细胞中,敲减SERPINA1后,仅G0/G1期增多.7.SERPINA1被抑制后,BCL-2的蛋白表达水平显著下降,而BAX的表达水平则有所升高,MMP9和MMP2的表达水平有所降低,而Timp-1和Cleaved Caspase-3的表达水平则有所升高.与对照组比较,这些变化都表明SERPNA1对胰腺癌生物学行为的抑制作用是显著的.敲减组的P-p38 MAPK,P-ERK1/2和P-JNK的表达水平也显著变化.结论:1.SERPINA1存在于多种胰腺癌细胞中,且在细胞核与细胞质中均存在表达.2.SERPINA1在人胰腺癌组织和细胞中的表达与在人癌旁组织和正常胰腺细胞中的表达存在显著差异,表现为其在mRNA和蛋白层面的表达水平均升高.3.SERPINA1能对人胰腺癌细胞的多种生物学行为造成显著影响,包括提高其增殖能力,促进其迁移及侵袭,并降低其凋亡水平,改变其细胞周期的分布等.4.SERPINA1可以显著影响MAPK通路中的某些关键蛋白,猜测其有可能通过此通路发挥对胰腺癌的调节作用.

展开