摘要：

目的:骨髓炎是临床骨科的重要疾病,严重威胁公众健康.然而,我们对骨髓炎发病机制的了解有限.引起骨髓炎的最常见细菌是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),其感染占所有骨髓炎病例的80%.金黄色葡萄球菌通常被认为是一种细胞外病原体.然而,有证据表明,金黄色葡萄球菌具有在多种细胞内生存的能力.金黄色葡萄球菌可以通过在细胞内增殖来逃避宿主防御机制和大多数治疗药物,这被认为与骨髓炎的持续感染有关.CircRNA(circular RNA)是高度保守的非编码RNA分子,具有封闭的环状结构,被认为是理想的生物靶点.竞争性内源性RNA(competitive endogenous RNA)机制被认为是circRNA发挥生物功能的主要机制.关于circRNA在骨髓炎发病机制中的作用知之甚少.破骨细胞作为"骨哨兵",是骨中的常驻巨噬细胞,被认为是骨髓炎发病机制中的关键靶点.目前,金黄色葡萄球菌被发现可以在破骨细胞中存活,但破骨细胞circRNA对细胞内金黄色葡萄球菌感染的所涉及的功能机制尚不清楚.本研究旨通过高通量测序技术研究在破骨细胞金黄色葡萄球菌胞内感染下circRNA的差异性表达谱;检测金黄色葡萄球菌所致骨髓炎小鼠模型骨组织,血清和骨髓炎患者血清中验证相关差异性表达circRNA的表达水平;后初步研究其在破骨细胞中的所涉及的功能机制.方法:本研究使用金黄色葡萄球菌(ATCC25923)感染RAW264.7诱导的破骨细胞,使用高通量测序筛选出差异表达的circRNA.然后对差异性表达的circRNA进行GO富集,KEGG通路分析,蛋白互作网络分析及ceRNA互作网络分析等在内的生物信息学分析.之后使用RT-qPCR验证关键差异性表达circRNA的表达水平.而后使用金黄色葡萄球菌所致骨髓炎小鼠模型,使用RT-qPCR验证其在体内条件下的表达.然后,使用骨髓炎患者血清验证关键差异性表达circRNA的表达.最后使用RT-qPCR及Western blot对可作为理想生物靶标的circRNA所涉及的机制进行初步研究,提出基于海绵机制的circRNA-miRNA-mRNA调节轴.结果:1.与对照组相比,在金黄色葡萄球菌胞内感染组中共检测出86个差异性表达的circRNA(差异倍数≥2,P<0.05).其中有24个上调和62个下调的circRNA.2.通过对差异性表达的circRNA进行分析,研究发现在金黄色葡萄球菌胞内感染条件下,大多数上调和下调的差异性表达circRNA的长度在500-2000 bp,在下调的差异性表达circRNA中,没有长度为在2000-5000 bp的circRNA;在染色体chr6,M和Y上没有发现任何下调的差异性表达的circRNA;在chr7,11,14和18上没有发现上调的差异性表达的circRNA,无论是上调还是下调的差异性表达circRNA,基因来源最多的类别都是外显子;7个新的上调差异性表达circRNA和17个下调的差异性表达circRNA是新发现的circRNA未在公开的circRNA数据库中被注释.3.通过对差异性表达的circRNA进行功能分析,GO富集分析结果显示,对于上调的差异性表达circRNA,在生物过程亚组中,最为富集的前3个条目是钙介导的信号传导,催化活性的正调节和细胞内信号转导.对于下调的差异性表达circRNA,前3个最为富集的生物过程亚组条目是细胞代谢过程,对刺激反应的调节和含磷酸盐化合物代谢.在分子功能亚组中,上调的差异性表达circRNA最为富集的3个条目是激酶活性,转移酶活性-转移含磷基团和转移酶活性,下调的差异性表达的circRNA最为富集的3个条目是结合,杂环化合物结合和离子结合.在细胞组分亚组中,上调的差异性表达circRNA主要富集在闰盘,细胞-细胞接触区和肌膜,下调的差异性表达circRNA主要富集在细胞器,细胞内部分和细胞内.在KEGG通路分析结果中,磷脂酶D信号通路,细菌侵入上皮细胞和Fc γR介导的吞噬作用是上调的差异性表达circRNA的最为富集的通路.在下调的差异性表达circRNA中,T细胞受体信号通路,B细胞受体信号通路和轴突引导是最为富集的信号通路.4.RT-qPCR结果显示,与未感染的破骨细胞相比,9个被挑选的,具有潜力的circRNA均在金黄色葡萄球菌胞内感染条件下出现差异性表达,且趋势与高通量测序的 circRNA 谱结果一致.其中 chr4:130718154-130728164+,chr8:77409548-77413627-和chr1:190871592-190899571-是上调倍数最高的3个差异性表达circRNA.在金黄色葡萄球菌所致的骨髓炎小鼠模型中,这3个circRNA在对照组和骨髓炎组之间的骨组织中均表现出表达上调.与对照组相比,chr4:130718154-130728164+和chr1:190871592-190899571-在骨髓炎小鼠血清样本中表达上调,chr4:130718154-130728164+上调水平较高.因为 chr4:130718154-130728164+的宿主基因(host gene)是Pum1,所以我们把该circRNA命名为circPum1.5.RT-qPCR结果显示,与健康个体相比,circPum1的表达在金黄色葡萄球菌所致骨髓炎患者的血清中显著上调.6.对破骨细胞采用siRNA-circPum1和阴性对照转染,使用细菌涂板法计算破骨细胞内的金黄色葡萄球菌.结果表明,circPum1的敲低导致破骨细胞内金黄色葡萄球菌的存活率增加.7.RT-qPCR 结果显示在 siRNA-circPum1 组中,miR-767 和 Pmp22 mRNA 的表达水平下调;在miR-767mimics组中,Pmp22 mRNA的表达水平上调.8.Western blot结果显示在siRNA-circPum1组中,Pmp22蛋白的表达水平下调;在miR-767 mimics组中,Pmp22蛋白的表达水平上调.结论:1.成功通过高通量测序技术,绘制了金黄色葡萄球菌胞内感染破骨细胞的circRNA表达谱.2.Chr8:77409548-77413627-,chr1:190871592-190899571-和 chr4:130718154-130728164+(circPum1)是诊断金黄色葡萄球菌所致骨髓炎的潜在靶标.3.CircPum1是诊断人金黄色葡萄球菌所致骨髓炎的理想血清靶标.4.CircPum1潜在调控金黄色葡萄球菌在破骨细胞内的胞内增值,可通过miR-767调控Pmp22的表达,这可在金黄色葡萄球菌所致骨髓炎的病理机制中扮演重要角色.

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