摘要：

目的:益肺散结丸是广州中医药大学第一附属医院院内制剂,经过临床验证,具有稳定瘤体,延长患者生存期的作用,在联合安罗替尼治疗晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的临床应用中展现出不俗的效果.拟从临床研究及基础实验两方面入手:(1)临床研究部分,通过回顾性队列研究,对比益肺散结丸联合安罗替尼(联合用药)与安罗替尼单药在三线及三线以上治疗的临床疗效及安全性;(2)实验研究方面,通过体内,外实验,明确益肺散结丸对小分子多靶点抑制剂安罗替尼的协同增敏作用,并探究益肺散结丸协同安罗替尼抑制肿瘤生长与转移的作用机制.以期为晚期NSCLC患者后线治疗提供一个优选,低毒的治疗方案,也为下一步开展前瞻性,多中心随机对照研究提供循证医学依据.方法:(1)临床研究:本研究为单中心,回顾性队列研究,收集2019年10月1日至2022年6月30日在广州中医药大学第一附属医院肿瘤中心接受联合用药或者安罗替尼单药治疗的三线或三线以上晚期NSCLC患者的临床及预后信息,探索联合用药与安罗替尼单药对无进展生存期(PFS),总生存期(OS),肿瘤标志物,不良反应的影响,并分析益肺散结丸联合安罗替尼的预后影响因素.(2)实验研究:实验研究分为体外及体内研究两个部分.体外研究方面,通过从成年SD大鼠中提取不同用药浓度的益肺散结丸含药血清,体外培养肺癌细胞H1975,选取效果最优的1×用药倍数,即按患者益肺散结丸一天用药量的相应比例的含药血清进行后续实验;运用CCK-8细胞实验评价1×益肺散结丸含药血清与安罗替尼单药,联合用药时对细胞增殖的协同抑制作用;采用Transwell实验,细胞划痕实验,平板克隆形成实验进一步验证联合用药对非小细胞肺癌细胞的侵袭,迁移,克隆形成能力的作用;并运用Western Blot法检测H1975细胞增殖通路主要蛋白p-C-kit,影响增殖转移相关蛋白Jagged-1,细胞凋亡关键蛋白Cleaved Caspase3以及细胞黏附相关蛋白Fibronectin的表达.体内研究方面,使用裸鼠皮下成瘤模型,记录益肺散结丸联合安罗替尼作用下裸鼠体重,瘤体大小及瘤体重量的变化情况;并通过免疫组化进一步验证肿瘤组织中细胞增殖转移相关蛋白Jagged-1,细胞黏附相关蛋白Fibronectin的表达.结果:(1)临床研究研究共纳入110例患者,其中安罗替尼联合益肺散结丸为治疗组(68例),安罗替尼单药组为对照组(42例),随访至2023年1月18日.①无进展生存期(PFS):治疗组的中位PFS(6.9个月)显著优于对照组(4.5个月)(P=0.011,HR=1.76,95CI:1.13-2.74),单药组的疾病进展风险是治疗组的1.76倍.单因素分析结果显示ECOG-PS评分(P=0.019),心脏疾患(P=0.005),安罗替尼的用药线数(P=0.005)与单药组患者相比,PFS具有显著差异;将上述单因素分析中P<0.05的与预后相关的因素进行Cox多因素回归分析,结果显示是否患有心脏疾患(P=0.025)有显著的统计学差异,说明患有心脏疾患是晚期NSCLC患者使用安罗替尼单药治疗的疾病进展危险因素.②总生存期(OS):治疗组的中位OS(27.7个月)显著优于单药组(15.1个月)(P=0.013,HR=1.88,95CI:1.13-3.12),且HR值显示单药组的死亡风险是治疗组的1.88倍.单因素分析结果显示ECOG PS评分(P=0.001),肿瘤TNM分期(P=0.021),病理类型(P=0.028),既往靶向治疗情况(P=0.042)与治疗组患者的OS差异具有统计学意义;将上述单因素分析中P<0.05的与预后相关的因素进行Cox多因素回归分析,结果显示ECOG PS评分(P=0.0041),肿瘤TNM分期(P=0.0208)有显著的统计学差异,说明ECOG-PS评分0-1分,肿瘤TNM分期为Ⅲ期是晚期NSCLC患者使用安罗替尼联合益肺散结丸的预后保护因素.与此同时,对两组基线中,两组间的性别(P=0.028),骨转移状态(P=0.003)及EGFR突变状态(P=0.054)三种变量进行倾向性匹配,以排除这三种不平衡因素对预后分析带来误差影响.倾向性匹配结果显示,共有84例患者符合匹配条件,其中治疗组和单药组各42例,详情见表6,各种因素在两组间均不存在显著差异.另外,对倾向性匹配后的两组患者采用Kaplan-Meier曲线法进行生存分析发现,治疗组的中位PFS为7.0个月,单药组中位PFS为4.7个月(P=0.043,HR=1.71,95CI:1.11-2.64),单药组的疾病进展风险是治疗组的1.76倍.另外,治疗组的中位OS为26.3个月,单药组中位OS为15个月(P=0.011,HR=1.83,95CI:1.21-3.03),单药组的死亡风险是治疗组的1.83倍,见图5.经过倾向性匹配调整后,联合用药和单药组在PFS和OS方面的P值均具有统计学意义,说明研究结果稳定,具有较强的可信度.③肿瘤标志物水平的比较,治疗组及单药组的肿瘤标志物(CEA,CA125,CA153)水平在治疗后均有一定程度的降低,但没有达到显著性差异(P>0.05).④中医证候积分的对比,治疗组的中医症候积分在治疗后显著降低(P=0.03),而单药组在治疗后稍有升高,但无显著差异(P=0.69).⑤治疗组的乏力,厌食的发生频率低于单药组,具有统计学意义(P<0.05),两组在高胆红素血症,转氨酶升高,肌酐升高,蛋白尿等不良反应的发生率的差异无统计学意义(P>0.05).(2)实验研究①体外研究CCK8实验结果显示益肺散结丸含药血清及安罗替尼对于肺癌H1975细胞具有一定的增殖抑制作用,安罗替尼的抑制作用更为显著且具有剂量依赖性,而益肺散结丸含药血清的抑制作用不具有剂量依赖性,其中1×用药倍数的益肺散结丸含药血清的抑制作用最显著.联合治疗发现,1×益肺散结丸含药血清可显著降低H1975细胞安罗替尼作用下的IC50值.细胞划痕实验结果显示,与对照组比较,益肺散结丸含药血清组和安罗替尼组以及联合治疗组的划痕宽度均较大,且差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.01,P<0.01).其中,联合治疗组的细胞划痕宽度最大.本实验结果表明,益肺散结丸含药血清及安罗替尼均能抑制H1975细胞的迁移能力,且治疗组的抑制作用最为显著.Transwell实验结果显示,益肺散结丸含药血清组和安罗替尼组,联合治疗组中的肺癌细胞穿过细胞小室滤膜的数量较对照组显著减少(P<0.01,P<0.001,P<0.001);其中,治疗组穿过滤膜的细胞数最少.结果表明,益肺散结丸含药血清组和安罗替尼均可以显著抑制H1975细胞的侵袭,而益肺散结丸含药血清联合安罗替尼对H1975细胞侵袭能力的抑制效果最显著.平板克隆形成实验结果显示,与对照组相比,益肺散结丸含药血清组和安罗替尼组,联合治疗组的H1975细胞克隆形成数目均显著减少,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.05,P<0.01).结果表明,益肺散结丸含药血清和安罗替尼组均能显著抑制H1975的增殖,其中,联合治疗抑制细胞增殖的作用最显著.Western blot结果显示,与对照组相比,益肺散结丸含药血清组,安罗替尼组,联合治疗组中的p-C-kit/C-kit,Jagged-1,Fibronectin蛋白表达显著下降(P<0.01),cleaved Caspase 3/Caspase3蛋白表达显著升高(P<0.05).结果表明,益肺散结丸含药血清,安罗替尼,联合用药均能抑制增殖分化蛋白的表达,粘连相关蛋白的表达以及促进细胞凋亡蛋白的表达,且联合治疗组比单药治疗组效果更优.②体内研究体内抑瘤实验结果显示,益肺散结丸对于H1975细胞的皮下移植瘤生长不具备明显的抑制作用.而相比安罗替尼单药,联合用药可显著地增强安罗替尼对肿瘤瘤体的抑制,并且缓解安罗替尼用药造成的裸鼠体重的减轻,起到"增效减毒"作用.皮下移植瘤瘤体免疫组化显示,益肺散结丸,安罗替尼,联合用药可抑制肿瘤组织内Jagged-1,Fibronectin蛋白的表达,并且治疗组的肿瘤组织呈现最显著的表达差异.结果表明,益肺散结丸,安罗替尼及联合用药均能抑制移植瘤中细胞粘连相关蛋白的表达.结论:本论文通过开展回顾性队列研究,初步证实益肺散结丸联合安罗替尼治疗晚期NSCLC,相比安罗替尼单药,可显著延长肺癌患者的无进展生存期和总生存期,改善中医症状,减轻毒副反应,联合治疗具有协同增效的治疗优势.在体外实验中,通过CCK8细胞实验,细胞划痕,Transwell以及平板克隆实验等,证实益肺散结丸含药血清可显著增敏安罗替尼对于H1975细胞增殖抑制作用,并增强对H1975细胞的侵袭,迁移,克隆形成能力的抑制.Western blot结果显示,益肺散结丸,安罗替尼以及联合用药组,均能下调p-C-kit/C-kit,Jagged-1,Fibronectin蛋白表达,尤其是联合用药组,具有更强的肿瘤细胞增殖抑制作用.此外,体内抑瘤实验显示,益肺散结丸联合安罗替尼可增强对裸鼠皮下成瘤的抑制作用,抑制肿瘤组织中Jagged-1,Fibronectin等蛋白的表达,从而削弱肿瘤细胞的黏附作用,抑制肿瘤的生长.

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