摘要：

目的:基于《辅行诀脏腑用药法要》简称《辅行诀》"体-用-化"配伍法则,通过体内实验评价大补肾汤治疗OA的有效性,利用复杂网络分析,分子对接,分子动力学模拟等方法结合细胞实验阐释《辅行诀》大补肾汤治疗骨关节炎(Osteoarthritis,OA)的关键靶点,靶向活性成分及其靶向作用机制,为大补肾汤治疗OA的临床应用和现代化开发提供实验依据.方法:1.建立OA大鼠模型,采用微计算机断层扫描技术(Micro computed Tomography,Micro CT)评价大补肾汤对关节软骨下骨结构的影响.利用苏木精-伊红(hematoxylineosin staining,HE)染色,番红O固绿染色,免疫组化等病理组织形态评价大补肾汤对软骨组织损伤的影响,并用ELISA评价大补肾汤对炎性反应的抑制作用.2.在TCMSP结合文献,收集大补肾汤各药味成分,利用相似性系综方法对大补肾汤成分进行靶点预测.在TTD,Drug Bank等数据库中收集OA靶点,取交集获得大补肾汤治疗OA靶点,并进行蛋白-蛋白相互作用网络构建和KEGG通路富集分析,得到关键靶点.确定COX-2和STAT1的活性位点,采用分子对接对COX-2和STAT1靶点进行标准精度(standard precision,SP)虚拟筛选,根据打分值和类药性分析,得到潜在活性成分.利用酶活性抑制实验评价潜在活性成分对COX-2的抑制作用.3.建立骨关节炎细胞模型,CCK8法确定靶向COX-2潜在活性成分最佳干预浓度,通过ELISA检测软骨细胞PGE2,IL-6,TNF-α的变化,免疫荧光检测软骨细胞基质合成蛋白CollagenⅡ,MMP13的表达.通过外植体实验,从软骨组织层面评价靶向COX-2潜在活性成分对软骨损伤的保护作用.LPS+IFN-γ建立M1型巨噬细胞极化模型,CCK8法确定靶向STAT1潜在活性成分最佳干预浓度,观察靶向STAT1潜在活性成分对M1型巨噬细胞形态的影响以及ELISA检测对M1型巨噬细胞标记物IL-6,i NOS,TNF-α的变化情况.构建人软骨细胞和M1型巨噬细胞共培养体系,ELISA检测共培养体系中分泌IL-6,i NOS,TNF-α的变化.采用分子模拟和结合自由能计算解析靶向COX-2,STAT1的代表性成分毛蕊异黄酮和原儿茶酸与靶蛋白之间相互作用情况.结果:1.大补肾汤能够抑制软骨下骨中骨小梁数量,厚度及密度,改善软骨及软骨下骨的损伤.HE,番红固绿染色,免疫组化结果显示,与模型组相比,大补肾汤组软骨组织中CollagenⅡ表达升高,MMP13表达有所下降.ELISA结果显示,与模型组相比,大补肾汤组明显降低了炎性因子IL-1β,IL-6和TNF-α等含量.2.通过蛋白-蛋白相互作用网络得到,大补肾汤治疗OA关键靶点主要涉及血管生成,炎症反应,细胞增殖与分化,免疫反应4个方面,其中,COX-2是调控炎症反应的关键靶点,STAT1是调控免疫反应的关键靶点.COX-2,STAT1可能是大补肾汤发挥"补,泻"作用的代表性靶点.KEGG通路富集分析主要调控肿瘤坏死因子(TNF-α),酪氨酸蛋白激酶JAK1(Tyrosine-protein kinase JAK1,JAK1),TNF-α等信号通路.将大补肾汤成分与靶蛋白COX-2,STAT1分别进行分子对接虚拟筛选,根据打分分值结合类药性分析,得到符合类药性靶向COX-2潜在活性成分76个,符合类药性靶向STAT1潜在活性成分53个.结合类药性,药味归属等选择7个靶向COX-2潜在活性成分进行酶活性抑制实验,其中,大黄素,毛蕊异黄酮,高丽槐素对COX-2有较好的抑制作用.3.靶向COX-2的潜在活性成分大黄素,毛蕊异黄酮,高丽槐素显著抑制PGE2的合成,同时抑制IL-6,TNF-α炎性因子的释放.大黄素,毛蕊异黄酮,高丽槐素抑制软骨细胞MMP13蛋白的表达,升高CollagenⅡ蛋白表达,促进细胞基质合成,对软骨具有保护作用.组织病理形态学可见,大黄素,毛蕊异黄酮,高丽槐素能够减缓软骨组织基质降解,改善软骨组织损伤.靶向STAT1潜在活性成分花旗松素,原儿茶酸,α-柏木烯减少巨噬细胞伪足的产生,同时,显著抑制了IL-6,i NOS,TNF-α的生成.代表性成分原儿茶酸能够显著抑制炎性因子TNF-α的释放,调节巨噬细胞极化从而起到对软骨细胞的保护作用.通过分子动力学模拟和结合自由能计算发现毛蕊异黄酮与COX-2能够稳定结合,主要与氨基酸SER 530,TRY 355有着较强的相互作用.STAT1与原儿茶酸主要与残基GLU 609和GLU 632有着较强的相互作用.结论:本论文遵循《辅行诀》"体-用-化"配伍法则,采用复杂网络分析,分子对接,分子动力学模拟结合细胞实验初步阐明了大补肾汤治疗OA的关键靶点,靶向活性成分及其靶向作用机制,为《辅行诀》原载方大补肾汤治疗OA提供了实验依据,同时为《辅行诀》配伍法则的研究提供一定方法学参考.

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