摘要：

由于较高的复发率和转移率,肺癌已经成为全球"头号癌症杀手",在世界范围内每年导致几十万人失去生命,几百万人忍受着病痛的折磨.中药治疗法作为近年来新兴起的手段受到了人们的广泛关注.甘草是我国传统的中草药,研究发现其有效成分及衍生物具有多种药理作用.因此,我们在查阅大量参考文献后,发现了一种甘草衍生物—18β-甘草次酸(18β-Gly),具有多种药理活性并表现出良好的抗肿瘤活性,但因其对肺癌的具体分子药理机制尚不明确,因此本实验利用肺癌(A549,NCI-H23及NCI-H460)细胞为体外模型,探究18β-Gly对肺癌细胞的杀伤作用,并进一步研究其对肺癌A549细胞的诱导凋亡作用及具体的分子机制.首先本实验通过CCK-8实验检测18β-Gly对肺癌细胞(A549,NCI-H23及NCI-H460)的杀伤作用以及对正常细胞(IMR-90,GES-1及293T)的毒副作用.Hoechst/PI双染实验在宏观上初步观察A549细胞是否出现类似凋亡的情况.将处理后的A549细胞(经Annexin V-FITC/PI染色)利用流式细胞术在细胞层面上检测凋亡情况.利用透射电镜(TEM)及流式细胞术进一步在细胞层面上检测线粒体的相关变化.利用Western blot实验在蛋白表达层面上检测各类相关蛋白的变化情况.流式细胞术检测A549细胞内活性氧(ROS)及细胞周期变化情况.最后,通过细胞划痕实验及Western blot法检测18β-Gly对A549细胞的抑制迁移作用及调控下游迁移蛋白的具体分子机制.18β-Gly对三种肺癌细胞均有良好的杀伤作用,其中以A549细胞最为敏感;此外,在正常细胞中,与阳性对照5-FU处理组相比,18β-Gly处理组的毒副作用较低.18β-Gly处理A549细胞后,线粒体发生肿胀变形,膜电位迅速下降,细胞色素C被大量释放,Bad,剪切的caspase-3及PARP蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下降,进而使A549细胞发生线粒体依赖性凋亡;另一方面,18β-Gly使p-p38和p-JNK的表达增加,p-ERK下降,接着引起p-STAT3,NF-κB下降和IκB-α的上升.18β-Gly上调p-p53蛋白的表达水平,抑制Cyclin B1及CDK1/2表达,激活p27及p21表达,诱导周期阻滞在G2/M期.18β-Gly通过激活MAPKs信号通路,进一步上调钙黏附蛋白E(E-cadherin),下调钙黏附蛋白N(N-cadherin),波形蛋白(Vimentin)及SNAI 1,从而抑制A549细胞的迁移.此外,18β-Gly能够使A549细胞内活性氧水平大量上升,从而激活MAPKs/STAT3/NF-κB信号通路,最终诱导细胞发生凋亡.综上,本实验中18β-Gly上调A549细胞内ROS水平,间接调控MAPKs/STAT3/NF-κB通路蛋白表达,从而表现出抗癌作用.本研究利用A549细胞系首次探究了18β-Gly对于肺癌潜在的抗癌分子机制,为中药提取物治疗肿瘤提供了一定的理论依据.

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