摘要：

目的:归芪白术方具有健脾益气,活血化瘀的功效,课题组前期已在临床中证实其对胃癌有较好的辅助治疗作用,且存在抑制胃癌细胞增殖,恢复T细胞活性的活性成分.结合前期研究基础,在中医理论的指导下,本研究拟以糖酵解关键酶PKM2为靶蛋白分析该方通过"化瘀以健脾"而抑制胃癌糖酵解能量供给,减少T细胞耗竭的作用,以免疫检查点PD-L1为靶蛋白分析该方通过"健脾而化瘀"解除免疫抑制,恢复T细胞活力作用,探究归芪白术方发挥健脾化瘀抗胃癌的作用机制和物质基础,为其进一步开发和应用提供实验依据.方法:首先,基于首次建立的复方"功效配伍"网络分析体系,初步阐释归芪白术方配伍规律的科学内涵;以网络数据为依据,通过体内实验证实归芪白术方通过调节CD8+T细胞免疫和糖酵解发挥"健脾化瘀"抗胃癌的作用.随后,以肿瘤糖酵解靶点PKM2和免疫检查点PD-L1作为研究对象,结合生物信息和临床样本,分析其在胃癌中的表达情况;通过胃癌细胞和T细胞体外共培养体系,明确以促进PKM2四聚化和PD-L1二聚化为靶向策略对抑制胃癌细胞增殖和恢复T细胞活性的可行性,并分析双靶点联合抗胃癌作用的机制.继而,通过多构象虚拟筛选策略分析归芪白术方中与PKM2和PD-L1有较好结合作用的潜在活性成分;再通过体外实验优选出对胃癌细胞增殖有抑制作用和对T细胞功能有恢复作用的活性成分.最后,通过胃癌细胞和T细胞共培养体系,明确PKM2和PD-L1代表化合物的靶向性,并评价其配伍对胃癌细胞的抑制作用和对T细胞功能的恢复作用.结果:归芪白术方能够促进胃癌荷瘤小鼠CD8+T细胞的抗肿瘤免疫,维持正常生命状态,减少异常代谢产物的产生.PKM2四聚化不仅能够抑制胃癌细胞增殖,还能抑制胃癌细胞过度消耗微环境中的葡萄糖和乳酸的产生,减少T细胞耗竭,增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用;PKM2四聚化联合PD-L1二聚化能够有效地抑制胃癌细胞增殖,增强T细胞对胃癌细胞的杀伤作用.基于对PKM2和PD-L1的多构象模拟,归芪白术方中有多个能与促进PKM2四聚化和PD-L1二聚化位点结合的化合物,其中Uralenol和Glycycoumarin分别与PKM2和PD-L1有较好结合作用,且对胃癌细胞增殖抑制和T细胞活性恢复有明显作用.Uralenol与Glycycoumarin的联合配伍能够有效地抑制胃癌细胞增殖,促进T细胞对胃癌细胞的杀伤作用.结论:归芪白术方中活性成分Uralenol能够促进PKM2四聚化,通过调节代谢和转录抑制胃癌细胞增殖,通过糖酵解途径减少葡萄糖消耗和乳酸产生,进而抑制T细胞耗竭,方中活性化合物Glycycoumarin能够促进PD-L1二聚化,解除T细胞免疫抑制,恢复T细胞活性;二者配伍共同发挥"健脾""化瘀"功效抑制胃癌细胞增殖,恢复T细胞抗肿瘤免疫活性.

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