摘要：

第一部分可视化间充质干细胞来源外泌体的制备及其在缺血性脑卒中模型示踪的实验研究研究目的:本实验旨在提取并构建可视化间充质干细胞来源外泌体(mesenchymal stem cell-derived exosomes,MSC-exos),应用近红外荧光成像动态观察和监测外源性间充质干细胞来源外泌体在缺血性脑卒中小鼠模型体内的迁移和归巢现象.研究方法:通过超速离心法提取间充质干细胞来源外泌体并进行鉴定,利用亲脂性荧光染料Di R构建可视化间充质干细胞来源外泌体.健康雄性C57小鼠随机分为2组:未标记间充质干细胞来源外泌体组(Unlabled MSC-exos组)和Di R标记间充质干细胞来源外泌体组(Labled MSC-exos组).将标记或未标记的间充质干细胞来源外泌体(100ug,200ul)经尾静脉注射入缺血性脑卒中小鼠模型体内,分别于注射前0天和注射后1,3,5,7,10,14天不同时间点采集近红外荧光图像,在信号峰值的时间点取小鼠各部分组织进行离体近红外荧光成像,并通过脑组织的免疫荧光染色进一步离体观察归巢后的间充质干细胞来源外泌体的定位.在第3天和14天分别取小鼠各部分组织进行离体近红外荧光成像,观察间充质干细胞来源外泌体的体内分布情况.研究结果:1)透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)结果显示间充质干细胞上清超离提取物呈椭圆形茶托样双层膜结构,大小较为均一;纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)结果显示粒径分布峰值为134nm;蛋白免疫印迹(western blot,WB)结果显示超离提取物表达外泌体的特征性膜蛋白CD9和CD63.2)体外近红外荧光成像显示间充质干细胞来源外泌体表现出Di R相关荧光信号,且荧光信号强度与其浓度高度相关.3)Labled MSC-exos组模型鼠的病灶区信号强度自第1天起开始显著增高,并在第3天达到峰值,与Unlabled MSC-exos组相比具有统计学差异(P<0.0001),而后呈下降趋势.4)第3天,Labled MSC-exos组模型鼠的肝脏组织相比于其他组织表现出极高的Di R信号强度;第14天,Labled MSC-exos组模型鼠的肠道组织可见Di R相关的信号.5)免疫荧光染色结果显示,部分间充质干细胞来源外泌体与神经元共定位.研究结论:本实验通过近红外荧光成像无创实时监测外源性间充质干细胞来源外泌体在缺血性脑卒中模型鼠体内长达两周的迁移,归巢和定位规律,证实部分外源性间充质干细胞来源外泌体归巢至脑缺血区并被神经元细胞所摄取;外源性间充质干细胞来源外泌体经肝脏代谢至肠道排出,是影响其归巢效率的重要原因之一.第二部分外源性间充质干细胞来源外泌体治疗缺血性脑卒中的实验研究研究目的:外源性间充质干细胞来源外泌体是治疗缺血性脑卒中的重要进展之一.本实验旨在通过磁共振T2加权成像(T2-weighted imaging,T2WI),弥散张量成像(diffusion tensor imaging,DTI)及传统组织学方法综合评价和分析外源性间充质干细胞来源外泌体对缺血性脑卒中小鼠的治疗作用.研究方法:健康雄性C57小鼠建立缺血性脑卒中模型后随机分为2组:磷酸盐缓冲液对照组(Control组)和间充质干细胞来源外泌体干预组(MSC-exos组),分别从尾静脉注射磷酸盐缓冲液(200ul)或间充质干细胞来源外泌体(100ug,200ul).在干预前及干预后第1,7,14天采集T2WI图像;在干预后第14天进行神经功能评分和DTI成像,结束后取小鼠脑组织进行WB分析和免疫组化染色.研究结果:1)在第14天,外源性间充质干细胞来源外泌体可以有效改善缺血性脑卒中小鼠的神经功能缺陷(P<0.05),减少脑梗塞体积(P<0.05).2)相比于Control组,MSC-exos组模型鼠的缺血周边区血管新生(P<0.05)和侧脑室下区神经发生(P<0.05)均显著增加,侧脑室下区的细胞增殖亦明显改善(P<0.05).3)MSC-exos组模型鼠的患侧内囊区弥散各向异性分数(fractional anisotropy,FA),白质纤维数量以及纤维长度在第14天均显著增加(P<0.05),且髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)免疫组化染色结果亦如此(P<0.05).4)外源性间充质干细胞来源外泌体可以使脑内促炎因子IL-1β的表达下调(P<0.05).研究结论:通过影像学方法和传统组织学方法证实,外源性间充质干细胞来源外泌体可以促进缺血性脑卒中小鼠的血管神经新生,白质纤维重塑及神经功能恢复,并且一定程度上可以抑制脑内炎症反应,是改善缺血性脑卒中预后的重要新兴物质.

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