摘要：

研究背景近年来在女性恶性肿瘤中,乳腺癌的发病率居高不下,并逐渐成为威胁全球女性的健康问题.现有研究表明,肿瘤细胞与其所处的环境是一个功能性整体,肿瘤细胞与肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)互相影响,共同促进肿瘤的发生及发展;乳腺癌的预后不仅受肿瘤细胞的生物学特性影响,同时也与TME的状态密切相关.TME由肿瘤细胞,多种间质细胞及细胞外基质等组成,共同参与诱导肿瘤增殖,刺激血管生成,抑制细胞凋亡及抑制免疫系统等过程,从而阻碍机体的抗肿瘤反应,有助于乳腺癌的进展和转移.既往针对乳腺癌的治疗多局限于肿瘤细胞本身,如传统的放疗,化疗及靶向治疗等通过相应药物杀伤肿瘤细胞;但针对肿瘤细胞的治疗存在耐药问题,即肿瘤细胞为保证自身的存活,会产生各种各样的耐药机制来逃避药物的靶向性,一旦机体产生耐药,相应药物的疗效就会大打折扣.关于肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes,TILs)及免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors,ICIs)等方面的研究进展,共同推进了免疫治疗在晚期三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)中的应用.近年来,研究者们通过研究TME对乳腺癌的调控作用及其潜在治疗价值,旨在通过靶向TME的方法调控肿瘤细胞的"土壤"环境,从而为乳腺癌的治疗提供新思路. 研究目的本文旨在通过研究TME的变化对乳腺癌的影响,对其进行相关性分析;以回顾性研究为基础,基于免疫组化分析及细胞共培养模型等手段探索乳腺癌TME中相关指标的动态变化,并分析其潜在机理及预后价值,从而为后续靶向TME的治疗提供理论基础. 第一部分系统性免疫炎症指数与乳腺癌预后的相关性分析 研究方法收集我院连续收治且符合入选标准的380例乳腺癌患者的临床病理资料,根据外周血系统性免疫炎症指数(systemic immune-inflammation index,SII)水平进行分组,对不同SII分组的乳腺癌患者进行临床病理因素比较,以乳腺癌特异性生存(breast cancer specific survival,BCSS)为结局指标进行预后分析,并以其中36例TNBC患者为亚组进行进一步生存分析. 研究结果结合ROC曲线界值法将患者分为高SII组和低SII组,其中高/低SII组分别为222例/158例;在肿瘤分期方面,SII水平与乳腺癌患者的肿瘤最大径及肿瘤TNM分期有相关性,肿瘤最大径>5cm(P=0.013)及肿瘤分期Ⅲ期(P=0.004)的患者主要为高SII水平,结果有统计学差异.SII水平在乳腺癌患者的年龄分组,手术方式,组织学分级及是否为TNBC等因素中均无显著差异.单因素及多因素分析结果显示,肿瘤TNM分期及术前外周血SII分组可能是乳腺癌预后的独立危险因素,在TNBC亚组分析中同样具有预后意义. 第二部分三阴性乳腺癌肿瘤微环境中相关指标的变化及预后分析 研究方法回顾性分析因原发性TNBC于我院进行手术,并在随访过程因乳腺癌复发或/和转移再次于我院进行手术治疗的患者,纳入符合标准的患者共62例,62例患者中43例复发/转移灶的分子分型仍为TNBC.以患者复发或/和转移后生存时间(post recurrence survival,PRS)为结局指标,结合常见临床病理因素及再次手术前外周血SII水平,对所有患者进行生存分析.对患者原发灶与复发/转移灶进行免疫组化指标染色,并对Ki-67指数,p53的状态,CD8的状态,程序性死亡受体-配体1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)的表达,T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(T cell immunoglobulin and mucin domain-3,TIM-3)的表达以及成纤维细胞活化蛋白α(FibroblastActivationProtein,FAPα)的表达进行比较分析. 研究结果本组患者两次手术平均间隔时间为29.05±25.79个月,对复发/转移灶的分子分型进行分析,69.4%的患者仍为TNBC,且其病理特点同样为高Ki-67指数及p53阳性表达.依据复发/转移灶的分子分型进行分组,非TNBC组再次手术原因为远处转移的比例超过50%,TNBC组患者的再次手术原因则主要为局部复发(P=0.029);两组患者初次手术时年龄,月经状态,手术方式,病理分期,组织学特点,再次手术前外周血SII水平,辅助治疗及解救治疗等方面均无统计学差异.单因素及多因素分析显示,初始肿瘤最大径及再次手术前SII水平可能是本组患者PRS的独立危险因素.对TNBC患者的原发灶与复发/转移灶进行免疫组化指标对比分析,结果显示复发/转移灶主要表现为p53阳性表达比例升高,CD8+TILs比例下降,以及PD-L1,TIM-3及FAP阳性表达比例升高等特点. 第三部分间充质干细胞共培养诱导乳腺癌细胞形态变化及免疫状态改变 研究方法选用经分离,培养及鉴定后,证实功能稳定的人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived MSCs, hAD-MSCs),分别与乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231细胞系共培养,模拟乳腺癌TME中的MSCs对乳腺癌细胞的作用.在共培养第0,1,3,7,10天分别观察乳腺癌细胞的形态变化,并收集两组肿瘤细胞的RNA及蛋白质,使用qRT-PCR及Westernblot方法在基因水平及蛋白水平分别检测,从而比较乳腺癌细胞在共培养过程中PD-L1相关免疫状态的改变. 研究结果在与hAD-MSCs共培养的状态下,乳腺癌MCF-7细胞与MDA-MB-231细胞均贴壁生长,MCF-7的细胞为偏圆形或呈多角形,而MDA-MB-231的细胞则偏梭形.基于hAD-MSCs的共培养模型可诱导乳腺癌MCF-7细胞发生形态变化,经过诱导的细胞形态由上皮样向间质样转变;同时,在共培养过程中,PD-L1的基因及蛋白表达逐渐上调,提示hAD-MSCs共培养可能引起乳腺癌细胞免疫状态的改变. 研究结论乳腺癌的预后不仅与肿瘤细胞的生物学特性有关,还与TME的变化密切相关.SII作为基于外周血淋巴细胞,中性粒细胞及血小板计数的综合指标,可能更全面地反映乳腺癌患者体内炎症和免疫状态,对乳腺癌患者的疾病特异性生存及病情进展都具有重要预测价值.TNBC患者在复发/转移过程中可能出现激素受体及HER-2状态改变,并可能因侵袭性增强而使TME表现为免疫抑制等特点;对复发/转移性乳腺癌患者在临床允许的条件性进行再活检,有助于后续治疗策略的制定.体外共培养条件下,hAD-MSCs能诱导乳腺癌MCF-7细胞产生形态变化,并可能诱导抑制性免疫微环境的形成;基于hAD-MSCs的共培养模型可能为研究乳腺癌细胞与TME的相互作用及机制提供思路.

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