摘要：

第一部分神经干细胞来源外泌体治疗缺血性脑卒中的作用研究目的本研究旨在从体内外水平通过人神经干细胞来源外泌体(hNSC-Exo)对缺氧神经干细胞的影响,探讨hNSC-Exo在治疗过程中的潜在作用.方法分离与培养人源海马神经干细胞(hNSCs),免疫荧光鉴定神经干细胞标志物.从神经干细胞培养上清中提取外泌体,使用透射电镜,纳米粒径分析(NTA)和western blot鉴定外泌体形态,大小和表面标志蛋白.使用PKH67标记外泌体,观察靶细胞摄取外泌体的情况.建立神经干细胞OGD/R模型(OGD-hNSCs),加入hNSC-Exo进行干预,通过免疫荧光染色评估OGD-hNSCs的凋亡和分化情况.建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注(MCAO)模型,将hNSC-Exo立体定向至大鼠颅内,通过mNSS,Rotarod test,Postural Reflex test评估大鼠的神经功能;免疫荧光评估大鼠神经凋亡和再生情况.以hNSC-Exo与PBS分别干预OGD-hNSCs,采用miRNA高通量测序技术检测两组中差异表达的miRNAs.结果神经干细胞体外培养时呈神经球样,表达特征性标志物Nestin,SOX2,能够向少突胶质细胞,神经元和星形胶质细胞分化;hNSC-Exo具有典型的外泌体形态,大小,表达标志物CD81,TSG101和HSP70.体外实验显示hNSC-Exo能够抑制OGD-hNSCs的凋亡和向星形胶质细胞分化,促进OGD-hNSCs向神经元的分化.体内实验显示hNSC-Exo能够显著提高脑缺血大鼠的神经功能,影响内源性缺氧神经干细胞的分化和缺血区周围神经细胞的凋亡.miRNA高通量测序和qRT-PCR显示,外泌体干预后OGD-hNSCs中miRNA-362-3p显著上调.结论 本研究初步证明人神经干细胞来源外泌体能够对缺氧神经干细胞及脑缺血组织发挥神经保护作用.第二部分神经干细胞来源外泌体促进内源性神经修复的机制研究目的本研究旨在从体内外水平研究人神经干细胞来源外泌体中的miRNA对缺氧神经干细胞和MCAO大鼠的影响.方法 以筛选出差异表达的miR-362-3p为研究对象,构建miR-362-3p过表达慢病毒载体和miR-362-3p稳定表达神经干细胞细胞株,提取外泌体(miR-362OE-hNSC-Exo);将miR-362OE-hNSC-Exo对OGD-hNSCs进行干预,qRT-PCR,免疫荧光和western blot评估细胞活性,分化情况,以及Wnt/β-catenin信号通路的影响;miR-362OE-hNSC-Exo定向移植到MCAO大鼠后评估大鼠神经功能,神经重建情况.利用生物信息学软件(starBase,Targetscan和miRDB)预测出miR-362-3p调控的下游靶基因,进行qRT-PCR验证;双荧光素酶报告基因验证miR-362-3p与靶基因的结合能力;western blot评估靶基因对Wnt/β-catenin信号通路的影响.结果 miR-362OE-hNSC-Exo和miR-NCOE-hNSC-Exo具有典型的外泌体形态,大小,表达标志物 HSP70,TSG101 和 CD81.体外实验显示 miR-362OE-hNSC-Exo 能够抑制 OGD-hNSCs的凋亡和向星形胶质细胞分化,促进OGD-hNSCs向神经元的分化,以及下游Wnt/β-catenin信号通路的激活.体内实验显示miR-362OE-hNSC-Exo能够提高脑缺血大鼠的神经功能,影响内源性缺氧神经干细胞的分化和缺血区周围神经细胞的凋亡.生物信息学与western blot发现miR-362-3p的下游靶基因黑色素瘤细胞黏附分子(MCAM),双荧光素酶报告基因分析,qRT-PCR分析证实miR-362-3p与MCAM互作关系.Western blot证实MCAM敲低能够影响神经干细胞分化和Wnt/β-catenin信号通路.结论 本研究初步证明人神经干细胞来源外泌体中的miR-362-3p通过负向调控MCAM,并激活Wnt/β-catenin信号通路影响缺氧神经干细胞的凋亡和分化,促进脑缺血大鼠的神经功能恢复.第三部分神经干细胞来源外泌体携载BDNF治疗缺血性脑卒中目的本研究旨在研究工程化外泌体BDNF-hNSC-Exo对应激损伤后神经干细胞和脑缺血大鼠的影响.方法 基于神经干细胞来源外泌体,转染脑源性神经营养因子(BDNF)后构建工程化外泌体 BDNF-hNSC-Exo,使用透射电镜,NTA 和 western blot 分别鉴定 BDNF-hNSC-Exo 和hNSC-Exo的形态,大小和标志性蛋白.通过过氧化氢干预建立氧化应激细胞模型,利用BDNF-hNSC-Exo进行干预,通过CCK8,TUNEL,western blot评估细胞活性及凋亡情况;qRT-PCR,western blot,免疫荧光评估细胞分化情况;将BDNF-hNSC-Exo定向移植到MCAO大鼠后,通过mNSS,Rotarod test,Postural Reflex test评估大鼠的神经功能;TTC染色评估大鼠脑梗死体积;免疫荧光评估大鼠神经重建情况.结果 BDNF-hNSC-Exo和hNSC-Exo具有典型的外泌体形态,大小,表达标志物HSP70,TSG101和CD81,不表达Calnexin蛋白.体外实验显示BDNF-hNSC-Exo能够抑制应激下神经干细胞的凋亡,促进其向神经元的分化.体内实验显示BDNF-hNSC-Exo能够提高脑缺血大鼠的神经功能,抑制小胶质细胞的表达,促进内源性缺氧神经干细胞向神经元的分化,以及减少脑梗死体积.结论 本研究初步证实BDNF-hNSC-Exo能够促进神经再生和存活从而发挥治疗作用.

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