摘要：

红树林作为海陆过渡潮间带特殊的生态环境,具有生物多样性高,物种资源丰富等特点,大量文献报道红树林来源微生物代谢产物具有丰富的生物活性,是结构新颖,骨架独特的新型化合物的重要来源之一,同时海洋真菌以其生长周期短,便于工业化规模培养,绿色环保可持续等优势从海洋天然产物研究中脱颖而出成为新药发现与研究的资源宝库.OSMAC(One Strain Many Compounds)策略即"单菌株多次级代谢产物策略",是通过改变同一菌株的培养条件和培养基组成等,尽可能激活沉默的生物合成基因簇,激发微生物代谢潜能的方法,是目前开发结构新颖的活性化合物的有效手段.本研究以分离自广西防城港北仑河口国家级自然保护区红树林沉积物的海洋真菌为研究对象,采用不同培养基不同盐浓度的OSMAC策略,以菌体生长状态,次级代谢产物丰富度,以及粗提物抗氧化活性为筛选指标,筛选出最优发酵培养基,运用现代色谱技术对其天然产物进行分离纯化,通过波谱解析确定其结构后对所得化合物进行生物活性测试.具体研究结果如下:(1)从广西防城港北仑河口国家级自然保护区红树林沉积物样品中分离得到85株可培养真菌,经过初步鉴定分布在3个门,10个纲,19个目,23个科,26个属.以尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)为病原菌对分离得到的菌株进行抑菌初筛,筛选得到抑菌活性较好且易于培养的真菌F93-1和F93-2,并采用五点对峙法以6株植物病原真菌为指示菌株,对其进行抑菌活性复筛,结果表明菌株F93-1对Fusarium oxysporum,Bipolaris sorokiniana,Rhizoctonia solani三株病原菌均有较高的抑制作用,F93-2对Fusarium oxysporum,Colletotrichum musae两株病原菌有较高的抑制作用.综合形态学特征,ITS-r DNA序列建树对其进行鉴定,确定F93-1为Penicillium sclerotiorum,F93-2为Talaromyces allahabadensis.(2)选用5种不同培养基,添加3种不同海盐浓度的OSMAC策略对菌株F93-1,F93-2进行最优培养基的筛选.通过观察发酵期间菌体生长状态,比较不同培养条件下的次级代谢产物高效液相色谱(HPLC)指纹图谱的差异性,以及各粗提物自由基清除活性,筛选出代谢产物丰富,抗氧化活性较强的发酵培养基.F93-1最优培养基为海盐浓度30‰的MEM培养基,在此条件下次级代谢产物DPPH自由基清除率EC50为126.1μg/m L;F93-2最优培养基为海盐浓度30‰的MYA培养基,在此条件下次级代谢产物DPPH自由基清除率EC50为82.7μg/m L.(3)以筛选的最优培养基对菌株F93-1进行大批量发酵,发酵产物通过乙酸乙酯萃取获得粗提物浸膏,通过正相硅胶柱,反相硅胶柱,葡聚糖凝胶柱,制备液相等现代色谱仪分离技术分离得到22个化合物,通过波谱解析确定其结构,22个化合物中包括:5个新化合物(3个酰胺类新骨架化合物,2个甾醇皂苷类新化合物);1个苯甲酸衍生物(邻苯二甲酸酯);1个萜类化合物(phyllanembioid F);3个聚酮类化合物(penicilazaphilone D,penicilazaphilone G);1个生物碱(Methylcordysinin A);5个杂环化合物(geumsanol F,(+)-(2R,3S)-2-chloro-3-hydroxy-3-methyl-γ-buty-rolacton,hypocrellone A,Rimboxo,cyclo(L-Pro-L-Phe));2个戊醇(甲基戊二醇,赤藓糖醇).(4)对分离得到的部分化合物进行抗菌,抗氧化活性测定,结果表明:11个化合物对食源性致病菌(金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,蜡样芽孢杆菌)有显著抑菌效果,其中化合物3对大肠杆菌MIC为7.8μg/m L,化合物18对金黄色葡萄球菌MIC为62.5μg/m L,对蜡样芽孢杆菌MIC为15.6μg/m L;化合物10,13,14,4具有较好的DPPH自由基清除活性,其中化合物4,EC50为749.89μg/m L.研究结果表明,红树林根际沉积物蕴含着大量可培养真菌资源,其部分菌株还具有丰富的植物病原菌抑菌活性和较高的DPPH自由基抗氧化活性.从Penicillium sclerotiorum中分离得到3个酰胺类新骨架化合物,2个新化合物和3个首次分离自Penicillium sclerotiorum的化合物,部分化合物具有较高的广谱食源性致病菌抑制作用和抗氧化活性,进一步表明了红树林特殊生境来源真菌天然产物具有结构新颖,活性显著的特点,丰富了天然产物数据库,为抗菌和抗氧化海洋药物的开发提供了多个潜在的活性小分子化合物.

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