摘要：

背景和目的: 高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia,HHcy)是心血管疾病的独立危险因素,参与动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)形成的多个环节.HHcy致AS的机制十分复杂,与促进凝血,炎症反应和氧化应激等密切相关.内皮功能障碍是AS关键环节,而内皮细胞凋亡又是内皮功能障碍的重要因素.内皮祖细胞(endothelial progenitorcells,EPCs)作为内皮细胞的前体细胞在内皮损伤后的修复和血管再生中起重要作用.阿托伐他汀作为临床上广泛用于降低胆固醇的他汀类药物之一,大量临床实验证实其能有效降低心血管疾病的发病率和死亡率.这种结果除了与阿托伐他汀能够有效调节血脂代谢相关,可能还与其消除炎症,稳定和消退AS斑块,改善内皮功能等调脂外作用密切相关.但是,到目前为止,HHcy的损伤机理及阿托伐他汀的保护机制并不十分清楚. 本研究通过建立ApoE基因敲除小鼠HHcy的动物模型,诱发AS斑块形成.观察阿托伐他汀干预性治疗,对AS斑块的影响;并在离体水平观察不同浓度Hcy对人脐静脉内皮细胞(human umbilicalvein endothelial cells,HUVECs)和小鼠骨髓EPCs活性,凋亡率及其他功能的影响,以及阿托伐他汀对两种细胞的干预效应,并对阿托伐他汀的作用机制进行初步探讨. 方法: 1.2%(wt/vol)L-蛋氨酸灌胃法建立ApoE基因敲除小鼠HHcy模型,按实验分组,给予不同剂量阿托伐他汀治疗1个月后,用高效液相色谱荧光法测定血浆同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平,相差显微镜下观察小鼠主动脉根部病理学形态,免疫组织化学法检测主动脉血管平滑肌SM-α-actin的表达,TUNEL法检测小鼠主动脉斑块中的细胞凋亡指数,NBT及光泽精化学发光法检测血管局部活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,光泽精化学发光法检测主动脉血管NADPH氧化酶(NADPH oxidase,Nox)活性,流式细胞仪测定小鼠骨髓EPCs数量. 2.体外培养HUVECs,Hcy单独或联合阿托伐他汀,甲羟戊酸,eNOS抑制剂(LNMA),氧自由基清除剂(NAC),Nox抑制剂(DPI),p38促细胞分裂剂激活性蛋白激酶(p38MAPK)阻断剂(SB203580)和caspase-3特异性抑制剂(Ac-DEVD-CHO)处理HUVECs后,用MTT比色法检测细胞活性,Annexin-V/PI流式细胞仪法,DNA凝胶电泳法检测细胞凋亡,荧光探针H2DCF-DA法检测细胞内ROS水平,光泽精化学发光法检测Nox活性,蛋白质印迹技术分析p-p38MAPK的表达.RT-PCR法检测caspase-3 mRNA的表达,分光光度比色法检测caspase-3活性. 3.体外培养小鼠EPCs,密度梯度离心法获取小鼠骨髓单个核细胞,培养7天后收集并鉴定贴壁细胞.观察不同浓度Hcy及NAC,DPI,SB203580预处理对EPCs凋亡,ROS水平,Nox活性和细胞培养液中NO水平的影响.不同浓度的阿托伐他汀处理后.用MTT比色法,改良Boyden小室,粘附能力测定实验和体外血管生成试剂盒,分别观察EPCs的增殖,迁移,粘附和体外血管生成能力.用Annexin-V/PI流式细胞仪法,TUNEL法检测细胞凋亡,荧光探针H2DCF-DA法检测细胞内ROS水平,光泽精化学发光法检测Nox活性,硝酸还原酶法测定细胞培养液中NO含量,RT-PCR法测定eNOS基因表达,蛋白质印迹技术分析p-Akt,p-p38MAPK的表达,分光光度比色法检测caspase-3活性. 结果: 1.ApoE-/-小鼠蛋氨酸喂养3月后,血浆Hcy水平升高,AS斑块形成.阿托伐他汀治疗1月后,呈剂量依赖性地降低小鼠血浆Hcy水平,延缓AS病变的进程,减少斑块内凋亡细胞数量,降低了血管壁局部ROS水平及Nox活性,并增加了小鼠骨髓EPCs的含量. 2.体外培养条件下,阿托伐他汀呈剂量依赖性和HMG-CoA依赖性抑制Hcy诱导的HUVECs凋亡.DPI,NAC,SB203580和Ac-DEVD-CHO预处理后,Hcy诱导的内皮细胞凋亡率下降,而LNMA预处理对HUVECs的凋亡率及活性氧生成无影响.阿托伐他汀能拮抗Hcy诱导的ROS的产生及Nox的活化.阿托伐他汀预处理还能拮抗Hcy诱导的p38 MAPK磷酸化,DPI,NAC和SB203580预处理也可发挥同样的作用,而Ac-DEVD-CHO预处理不影响p38MAPK磷酸化.阿托伐他汀,SB203580预处理能抑制caspase-3 mRNA表达和活性的增加,甲羟戊酸能部分逆转阿托伐他汀的上述作用. 3.体外培养条件下,Hcy呈时间,剂量依赖性诱导EPCs凋亡,ROS的产生及Nox的激活并减少细胞培养液中NO含量.NAC,DPI,SB203580和阿托伐他汀预处理能拮抗Hcy诱导的上述改变.阿托伐他汀预处理可剂量依赖性地改善EPCs增殖,迁移,粘附和体外血管生成功能并上调eNOS基因及p-Akt蛋白的表达,下调p-p38 MAPK的表达及抑制caspase-3的活性. 结论: 阿托伐他汀治疗后,HHcy ApoE-/-小鼠AS病变进程延缓,其作用机制与其下调Nox来源的ROS水平,上调AM/eNOS来源的NO,拮抗p38 MAPK及caspase-3的活化,进而抑制HUVECs及EPCs凋亡,增加EPCs的增殖,迁移,粘附和体外血管生成功能有关;这有助于对HHcy患者心血管疾病的防治.

展开