摘要：

目的:近30多年来,我国肺癌发病率和死亡率呈上升趋势.放射治疗作为肺癌治疗的主要手段,适用于从早期到晚期不同临床分期阶段肺癌的治疗,超过半数的患者在其疾病演进过程中至少需要接受一次根治或姑息性放射治疗.然而,约40%—50%的肺癌患者接受常规放射后疗效不佳,致使肿瘤复发或转移.放疗抵抗是导致局部治疗失败的主要因素.因此,探索放疗抵抗的分子机制并寻找新的治疗策略具有重要的临床价值.长链酰基辅酶A合成酶1(Long-chain acyl-Co A synthetase 1,ACSL1)是长链酰基辅酶A合成酶家族的同工酶,可促进脂质合成和脂肪酸氧化.已有研究发现ACSL1与多种类型肿瘤的发展密切相关,但在非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)放疗抵抗中的作用尚不清楚.本研究旨在探究ACSL1在NSCLC放疗抵抗中的作用及其机制,为肺癌治疗提供新的思路.方法:(1)克隆形成实验,Ed U实验,CCK8实验检测ACSL1对肺癌细胞生长增殖的影响;(2)中性彗星实验,γH2AX焦点形成实验和细胞克隆形成实验检测ACSL1对肺癌细胞放射敏感性的影响;(3)裸鼠皮下移植瘤模型探究敲低ACSL1对移植瘤生长的作用,以及对放疗后移植瘤的影响;(4)构建肺癌射线抵抗细胞株,检测ACSL1的表达情况;(5)油红O染色,BODIPY 493/503染色检测细胞内的脂滴数目及大小;(6)Western blot实验检测敲低ACSL1后细胞内脂代谢通路关键酶的表达;(7)液相色谱-质谱联用仪(Liquid Chromatograph Mass Spectrometer,LC-MS)对肺癌细胞进行脂质组学检测;(8)ATP实验,Seahorse实验,线粒体活性染色,线粒体DNA拷贝数实验验证敲低ACSL1对线粒体功能的影响;(9)酶标仪检测肺癌细胞内NAD+/NADH水平,流式细胞术检测ROS水平;(10)RNA测序技术探究ACSL1下游作用机制;(11)免疫共沉淀实验验证蛋白之间的相互作用;(12)免疫组织化学染色检测下调ACSL1后下游相关蛋白的表达.结果:(1)siRNA及sgRNA敲低ACSL1在体内外抑制肺癌细胞的生长;(2)ACSL1在放射抵抗细胞株中的表达升高;(3)彗星拖尾实验,γH2AX焦点形成实验和放疗后克隆形成实验证实敲低ACSL1能够增加肺癌细胞的放射敏感性;(4)敲低ACSL1可以增加肺癌移植瘤的放射敏感性;(5)油红O染色和BODIPY 493/503实验发现敲低ACSL1后肺癌细胞内脂滴聚集减少;(6)脂质组学分析发现下调ACSL1可以降低放疗后肺癌细胞内的心磷脂水平;(7)Western blot实验证实敲低ACSL1后心磷脂合成酶(Cardiolipin synthase 1,CRLS1)的表达下调;(8)敲低ACLS1的表达能够降低放疗诱导的细胞内ATP水平,并且部分依赖于CRLS1;(9)Seahorse线粒体压力测定实验,线粒体活性染色实验,线粒体DNA拷贝数检测实验证实敲低ACSL1能够抑制放疗后的线粒体功能,降低线粒体ATP的产生;(10)敲低ACSL1后,细胞内NAD+/NADH比值升高,ROS升高,细胞氧化磷酸化水平下降;(11)RNA测序及western blot实验结果发现ACSL1通过激活PI3K/mTOR信号通路来诱导CRLS1的表达;(12)Western blot实验发现外源性补充棕榈酸后细胞内的mTOR信号通路被激活;(13)Co-IP实验验证了肺癌细胞内源表达的ACSL1与磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphoinositide-3 kinase,PI3K)之间的相互作用;(14)免疫组化染色证实敲低ACSL1后肺癌组织中p-mTOR和CRLS1的表达下调.结论:ACSL1在肺癌放疗抵抗细胞中呈高表达,并且能够在体内外促进肺癌细胞的生长增殖和放疗抵抗.机制方面,ACSL1能够通过促进脂质合成以及与PI3KR2的相互作用激活mTOR信号通路,促进下游CRLS1的表达,进而使线粒体ATP的产生增加,为放疗后DNA损伤修复提供能量,最终导致肺癌放疗抵抗.本研究提示ACSL1可能是肺癌放射治疗抵抗的潜在靶标.

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