摘要：

研究背景在各个国家导致死亡的主要原因均是癌症,也是延长预期寿命的重大挑战.据统计,胰腺癌在所有癌种中的发病率排名第八,但在所有肿瘤中,胰腺癌在癌症死亡原因中排名第三.近50年来,随着医疗水平的发展,进步,绝大部分癌种的5年生存率已达到50%以上水平,但胰腺癌的5年生存率仅11%,是所有肿瘤中最低,是人们攻克疾病中的重大挑战.胰腺癌发病受遗传变异(基因突变),环境(如糖尿病,吸烟,肥胖和大量饮酒等)多因素的影响.胰腺癌的病理分型90%为导管腺癌,少见类型有黏液性囊腺癌,腺泡细胞癌和鳞腺癌.目前胰腺癌的治疗上主要是手术及放化疗治疗.手术治疗对于中期胰腺癌效果相对较好,但总体上手术后复发率较其他癌种较高.大多数胰腺癌发病隐匿,早期症状不突出,且没有灵敏准确,高效的早期诊断方法.大多数患者发现时均已是胰腺癌进展期,丧失手术机会,而且临床上放,化疗效果欠佳,患者预后差.因此,探索新的,更有效的胰腺癌治疗方案,对胰腺癌患者具有重大意义.根据NCCN指南推荐的胰腺癌临床治疗方案.单用吉西他滨;以吉西他滨为基础的联合用药,如吉西他滨联合白蛋白结合性紫杉醇,替吉奥,厄洛替尼,氟尿嘧啶,顺铂;卡培他滨联合5-氟尿嘧啶;GTX方案(吉西他滨,多西他赛,卡培他滨);FOLFIRINOX方案(奥沙利铂,伊立替康,亚叶酸钙,5-氟尿嘧啶),其中FOLFIRINOX4药联合方案有着不错的疗效.多药联合副反应大,很多胰腺癌患者无法耐受,虽然单药方案副反应低很多,但疗效上却难以保证.NCCN指南推荐绝大多数胰腺癌患者进行临床试验.可想而知,现有方案难以达到满意疗效.目前针对DNA损伤反应(DDR)修复通路的ATR激酶抑制剂在大多癌种中均表现出良好的效果.Charrier J等人通过高通量筛选筛选出第一个高效,高选择性ATR抑制剂VE-821,并发现VE-821可显著增强人结肠癌细胞HCT116对吉西他滨的敏感性,而且这种作用不会影响正常细胞.紧接着Prevo R等人发现将VE-821联合放疗及吉西他滨作用胰腺癌细胞,发现VE-821显著增强了胰腺癌细胞对辐射和吉西他滨的敏感性.VE-821的高选择性衍生物VE-822,研究表明VE-822联用顺铂或PI3K抑制剂对食管癌有强大的抗肿瘤作用.并且VE-822联合吉西他滨治疗卵巢癌患者,VE-822联合拓扑替康或吉西他滨治疗非小细胞肺癌患者等临床试验中均获得良好疗效.另一种选择性抑制剂AZD-6738也有良好疗效,比如AZD-6738联合喜树碱类似物,拓扑异构酶Ⅰ抑制剂抑制卵巢癌细胞增殖,AZD-6738联合吉西他滨抑制胰腺癌细胞增殖;AZD-6738联合PARP抑制剂奥拉帕利治疗卵巢癌患者,AZD-6738联合度伐利尤单抗治疗胃癌患者等临床试验均有持久,良好效果.ATR抑制剂抗胰腺癌细胞的机制尚待进一步研究在本课题中,我们旨在探讨ATR抑制剂对胰腺癌细胞生长及增殖的影响及机制,为治疗胰腺癌患者提供新的思路.研究方法1.通过体外实验检测ATR抑制剂AZD-6738及VE-822对胰腺癌细胞株6606PDA,MIA Paca-2,SUIT2 的敏感性(1)通过CCK-8实验分别检测胰腺癌细胞株6606PDA,MIA Paca-2,SUIT2对ATR抑制剂AZD-6738及VE-822的药物敏感性,使用GraphPad Prism8.0分别计算IC50值.(2)通过克隆形成实验,活死细胞染色,台盼蓝染色实验分别检测检测胰腺癌细胞株6606PDA,MIA Paca-2,SUIT2对ATR抑制剂的药物敏感性.2.通过体外实验检测ATR抑制剂VE-822联合FOLFIRINOX方案对胰腺癌细胞株 6606PDA,MIA Paca-2,SUIT2 的敏感性(1)通过CCK-8实验分别检测胰腺癌细胞株6606PDA,MIA Paca-2,SUIT2对FOLFIRINOX方案及ATR抑制剂VE-822联合FOLFIRINOX方案的药物敏感性,利用金正均公式判断两药联合的作用性质.(2)通过克隆形成实验,活死细胞染色,台盼蓝染色实验分别检测检测胰腺癌细胞株 6606PDA,MIA Paca-2,SUIT2 对 ATR 抑制剂 VE-822 联合 FOLFIRINOX方案的药物敏感性.3.通过分子细胞生物学实验探讨ATR抑制剂增强细胞死亡的作用机制及ATR抑制剂增强胰腺癌细胞药物敏感性的作用机制(1)蛋白印迹实验,在胰腺癌细胞6606PDA细胞中检测死亡相关通路自噬,焦亡的影响.(2)根据二代测序筛选出胰腺癌细胞6606PDA细胞在VE-822影响后ABC转运体相关蛋白表达改变,利用蛋白印迹实验,在胰腺癌细胞6606PDA细胞中检测ABC转运体相关通路CFTR表达的影响.研究结果1.ATR抑制剂抑制胰腺癌细胞增殖及促进胰腺癌细胞死亡.在ATR抑制剂对胰腺癌细胞株6606-PDA,MIA Paca-2和SUIT2细胞增殖及死亡实验中,我们发现ATR抑制剂对胰腺癌细胞有较强的抑制作用,ATR抑制剂以剂量依赖性方式减少细胞增殖及促进细胞死亡,且在胰腺癌细胞中,ATR抑制剂VE-822较AZD-6738作用更强.2.ATR抑制剂VE-822联合FOLFIRINOX方案抑制胰腺癌细胞增殖.在ATR抑制剂VE-822联合FOLFIRINOX方案中,我们发现与对照组处理的细胞相比或与单用VE-822或单用FOLFIRINOX处理相比时,VE-822联合FOLFIRINOX方案的组合在同等单药用量情况下有着更强的抑制细胞增强及促使细胞死亡的作用,并通过金正均公式(Q=E(a+b)/(Ea+Eb-Ea×Eb))计算联合用药Q值均大于1.15,VE-822联合FOLFIRINOX方案存在协同作用.3.ATR抑制剂通过增强细胞自噬作用促使细胞死亡.为了解ATR抑制剂VE-822如何促进细胞死亡,我们进行了细胞死亡中焦亡,铁死亡,自噬等相关蛋白的尝试,最后发现ATR抑制剂明显的增强了自噬相关蛋白P62,LC3B的表达,从而确认VE-822主要增强细胞自噬从而促进细胞死亡.4.ATR抑制剂VE-822通过抑制ABC转运体表达增敏FOLFIRINOX方案抑制胰腺癌细胞增殖.根据前期测序结果,我们进行ABC转运体相关蛋白的尝试,结果发现VE-822明显降低了 ABC转运体相关蛋白CFTR的表达.结论:1.ATR抑制剂VE-822对胰腺癌细胞有显著抑制作用.2.ATR抑制剂VE-822联合FOLFIRINOX方案对胰腺癌细胞有协同抑制作用.3.ATR抑制剂VE-822可增强细胞自噬从而促进胰腺癌细胞死亡,ATR抑制剂可抑制ABC转运体相关蛋白表达,降低胰腺癌细胞药物耐药,从而增强药物敏感性.

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