摘要：

决定G-病原菌致病的主要因子是其细胞壁外膜成分——脂多糖(LPS)或称内毒素,内毒素血症及与其有关的疾病是人和动物感染死亡的重要原因.内毒素结合蛋白及其受体在机体识别与调控内毒素作用中发挥重要作用,尤其脂多糖结合蛋白(LBP)与杀菌/通透性增加蛋白(BPI)起了关键作用.BPI对G-具有广泛的杀菌作用,在机体内被喻为"超级抗生素".LBP能与LPS结合,并经过胞内信号传递诱发炎症反应,LBP与炎症反应有着重要的关系.本研究选取具有能杀灭多种G-及中和细菌内毒素的BPI和内毒素结合蛋白/特异受体LBP为研究对象,通过对猪LBP和BPI基因遗传变异研究,克隆猪LBP和BPI基因的功能片段,并初步探讨其功能,取得如下结果: 1,通过对猪BPI基因内含子10和LBP基因内含子9 DNA研究,发现猪BPI内含子10存在12个SNP位点和1个263bp插入/缺失片段;猪LBP内含子9存在9个SNP位点.分别应用特异PCR和PCR-RFLPs技术检测了猪BPI基因内含子10长度多态性和猪LBP基因内含子9的1个SNP位点(T334C)的多态性,结果表明:凉伞猪,龙潭猪群体中BPI基因内含子10长度多态性发现有A和a两个等位基因存在,该两种等位基因A/a频率在两个群体中分别为0.582/0.418和0.799/0.201.LBP基因内含子9的1个SNP位点(C344T)也具有两种等位基因T/C,在凉伞猪,龙潭猪群体中均被检测到,等位基因T/C频率在两个群体中分别为0.782/0.218和0.688/0.312.基因座在两群体中均处于Hardy-Weinberg平衡状态.应用最小二乘法模型分析,发现猪BPI基因长度多态的AA与aa基因型个体在45日龄重,6月龄重和6月龄胸围上存在显著差异(P0.05),AA基因型的初生重,45日龄重,60日龄重,4月龄重,6月龄重,6月龄体高,6月龄体长,6月龄胸围均优于aa基因型个体.不同基因型个体间初生重,60日龄重,4月龄重,6月龄体高和体长差异不显著(P0.05).对于LBP基因第9内含子的SNP多态,暂未发现其对生长性状造成显著影响.本研究结果还有待于在更多的群体中进一步验证和确认,以明确能否应用于猪标记辅助选择育种. 2,本研究从血液总RNA中克隆出猪BPI和LBP的全长cDNA序列.猪BPI基因1874 bp(基因登录号:FJ810853),其1452 bp的开放阅读框编码483个氨基酸残基,含13.25%的亮氨酸,有一段27个氨基酸的信号肽序列;猪LBP基因1648 bp,其1446bp的开放阅读框编码481个氨基酸残基,含14.94%的亮氨酸,有一段25个氨基酸的信号肽序列;序列相似性分析结果显示,哺乳动物BPI在进化过程中具有较高的保守性,与人,牛,兔,狗,大鼠,小鼠,鲤鱼,非洲爪蟾,大西洋鲑和大黄鱼的BPI分子氨基酸序列的相似性分别为64%,,74%,59%,67%,53%,51%,35%,44%,28%和27%.该蛋白氨基端部分和羧基端部分为两个明显不同的功能区,各存在一个超活性结构域.LBP在进化过程中具有较高的保守性,与人,牛,兔,鹿,大鼠,小鼠,猴的LBP分子氨基酸序列的相似性分别为74%,77%,66%,76%,63%,64%和73%.通过对猪BPI和LBP的生物信息学分析,推测猪BPIN端肽具有杀菌活性,猪LBPN端肽具有与LPS的类脂A结合的功能,但不介导信号传导.研究结果对阐明猪BPI和LBP在介导机体免疫反应机制中的作用具有重要意义,为寻找诊断,预防和治疗免疫相关疾病的新策略提供重要的理论基础. 3,通过设计猪BPI氨基部分特异性引物(引物的末端包含特定的酶切位点),成功克隆了猪BPIN端DNA序列,并正确插入原核表达载体pET32a(+)中,进行原核表达,对该重组蛋白进行分离纯化,测定重组蛋白的体外杀菌活性.结果显示,重组猪BPI肽对G+无杀菌能力,与G-作用在20min-2 h内杀菌力最强;重组猪BPI肽在—20,4,20,40和60℃作用30 min仍具有明显的杀菌活性;在不同pH值条件下的杀菌活性表现为酸性条件下增强,碱性条件下弱;对于同一细菌表现为浓度越高杀菌力越强.本研究构建了一株生产重组猪杀菌蛋白的基因工程菌,该菌株被命名为E.coli BL21(DE3)-pET32a(+)-pBPIN,已被中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号为CCTCC M 2011252,并已申报国家专利. 4,同样地,通过设计猪LBP氨基部分特异性引物(引物的末端包含特定的酶切位点),成功克隆了猪LBP N端DNA序列,并正确插入真核表达载体pcDNA3.1 (+)中,重组质粒转染Vero细胞,转染后成功用RT-PCR和Western blot检测到重组质粒的转录产物和重组蛋白.利用电脉冲介导,将重组质粒免疫小鼠双侧胫骨前肌,然后用鼠伤寒沙门氏菌进行攻毒,测定小鼠体温及血液中的部分免疫指标:白细胞数,中性粒细胞数和淋巴细胞数等.结果显示,第1周测定项目白细胞数对照组和重组质粒组之间有显著差异(P0.01),淋巴细胞数,中性粒细胞数对照组和重组质粒组之间均无显著差异(P0.05);第2周,第3周,第4周所测指标在对照组和重组质粒组之间均有极显著差异(P0.01).说明注射重组质粒小鼠的抗炎能力明显优于注射空质粒小鼠.

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