摘要：

为了发掘新型安莎类抗生素,我们利用安莎霉素共同起始单元AHBA合成基因簇中保守的AHBA合酶基因为筛选探针在实验室现有菌株中筛选到了三种不同类型的含AHBA合酶基因的合成基因簇:1)链霉菌xzqhl2基因组上的具有PKS的典型ansa类合成基因簇;2)链霉菌xzqhl2基因组上不具有PKS的非典型ansa类合成基因簇;3)小单孢菌A29基因组上的NRPS-PKS杂合合成基因簇(通过分析一株基因序列与A29具有99%一致性,且已经完成全基因组测序的小单孢菌L5的基因组序列推测得知). 为了能够更好的对小单孢菌A29进行遗传操作以激活其代谢途径,我们选用了A29菌丝体作为遗传操作对象.以链霉菌噬菌体ΦC31所构建的整合型载体pSET152为重组质粒,通过对遗传操作相关条件的摸索优化,建立了一套高效率且具有一定通用性的小单孢菌接合转移操作体系. 我们通过实验结果的比较,确定了一套小摇床高转速的小单孢菌菌丝体培养方案,培养出大量适合遗传操作的细嫩且分散的菌丝体.以菌丝体为操作对象我们分别进行了电转化和接合转移两种遗传操作方法的尝试.其中菌丝体电转化结果不佳,推测可能是因为小单孢菌胞壁较厚,很难通过电击等物理方式将重组质粒转化至小单孢菌体之中. 同时,我们发现大肠杆菌-小单孢菌菌丝体属间接合转移却可以很高效率的完成目的重组质粒的转入.通过优化菌丝体的生长状态,接合转移培养基种类,接合转移供受比,我们将大肠杆菌(ET12567/pUZ8002/pSET152)和A29菌丝体属间接合转移的效率提高到了10%以上,远远超过了文献报道中同类型的小单孢菌孢子接合转移的效率.同时,我们还测定了不同大小的插入片段和多株不同种的小单孢菌在该体系进行接合转移时的效率,证明了该体系对不同片段大小的重组质粒和不同种类的小单孢菌均适用. 解决了小单孢菌遗传操作的困难后,我们对筛选得到的三种类型的含AHBA合酶基因的次级代谢途径进行了测定和激活.通过进行野生型和关键合成基因缺失的突变株代谢谱的比较,我们发现这三种合成基因簇或不表达或表达水平较低,故对这三种基因簇进行了一系列基因调控. 在xzqhl2中增加一套来源于霉菌LZ35的RNA聚合酶基因并未激活含AHBA的合成基因簇,推测RNA聚合酶基因并非为该基因簇沉默的关键原因.对xzqhl2中ansa类合成基因簇上的LuxR进行过表达之后,分离差异峰获得的化合物并不符合预期,并不是目标基因簇合成的化合物.推测可能的原因是过表达产生的LuxR家族蛋白,可能不仅仅指发挥途径专一性调控,也对别的次级代谢基因簇的表达产生了影响,可能参与了菌体次级代谢的全局调控. 对A29中TetR基因和PadR基因的敲除,并未激活A29中的NRPS-PKS杂合次级代谢途径,推测可能的原因是基因簇中TetR和PadR本身未表达,或是表达出的TetR家族和PadR家族并非是负调控因子.对基因簇中的LuxR利用强启动子ermE*p启动子在菌株中过表达后,对比与对照菌的代谢谱发现有差异峰出现,但峰值不高,需要进一步的验证和对差异峰对应化合物进行分离,确定结构,来确定是否真正激活了该杂合代谢途径.

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