摘要：

[背景]胰腺癌是一种预后极差的消化系统恶性肿瘤,其5年生存率不足5%。吉西他滨作为胰腺癌的一线治疗药物,有效率低于20%。化疗耐药是吉西他滨治疗胰腺癌失败的主要原因,耐药机制主要有Mdr-1编码的P-gp蛋白增加药物外排,以及抗凋亡蛋白Bcl-XL激活后抑制吉西他滨诱导的细胞凋亡。Pim-3作为具有丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶的原癌基因,可以使Bad蛋白112位的丝氨酸发生磷酸化,削弱与Bcl-XL的结合作用,从而释放出抗凋亡蛋白分子Bcl-XL,进而发挥抗凋亡作用。目前尚未有明确证据证实Pim-3与胰腺癌吉西他滨耐药有关。 [目的]本研究的目的是阐明Pim-3促进胰腺癌生长和血管新生的作用,探讨Pim-3与吉西他滨耐药的关系,明确Pim-3在胰腺癌吉西他滨耐药中的作用,并分析其作用的分子机制。 [方法]1.将构建的稳定过表达Pim-3以及Pim-3激酶失活的人胰腺癌细胞株原位接种到裸鼠胰腺,MRI检测胰腺肿瘤生长情况,免疫组化检测PCNA, CD31和VEGF蛋白表达,蛋白免疫印迹杂交分析Pim-3与VEGF的表达。2.吉西他滨体外处理稳定过表达Pim-3和稳定敲除Pim-3的胰腺癌细胞株后,利用CCK8试剂盒检测吉西他滨的细胞毒性作用,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡。胰腺癌细胞株裸鼠胰腺原位接种后,给予吉西他滨处理,测量裸鼠胰腺原位肿瘤的大小,利用免疫组化检测细胞增殖和血管新生,[unnel凋亡染色检测凋亡细胞。蛋白免疫印迹杂交检测相应的胰腺癌细胞和组织内,相关信号分子蛋白表达改变。3.间歇浓度递增法诱导建立胰腺癌吉西他滨耐药细胞株,利用CCK8试剂盒、流式细胞术、原位移植肿瘤模型等手段,检测耐药细胞的生物学特性。利用RNA干扰技术敲除耐药细胞中的Pim-3后,利用CCK8试剂盒、流式细胞术观察耐药细胞株对吉西他滨耐药的敏感性,蛋白免疫印迹杂交检测细胞相关信号分子表达变化。 [结果]1.过表达Pim-3的胰腺癌细胞株(Miapaca-2-Pim-3)无论在体内还是体外实验中,细胞增殖均明显高于亲本细胞株Miapaca-2,而且过表达Pim-3的细胞形成的肿瘤组织中,新生血管增多。蛋白免疫印迹杂交和免疫组化检测发现,过表达Pim-3的细胞和组织中,VEGF表达上调。2.RT-PCR和Western Blot实验结果显示吉西他滨可以诱导胰腺癌细胞Pim-3的mRNA水平和蛋白水平表达上调,提示Pim-3可能参与了吉西他滨耐药。体外吉西他滨处理胰腺癌细胞,结果显示,吉西他滨在一定程度上抑制亲本细胞(Miapaca-2)的细胞增殖和细胞周期进程,并且在一定程度上引起细胞凋亡。过表达Pim-3可以拮抗吉西他滨的上述细胞毒作用。进一步裸鼠体内实验结果也显示,过表达Pim-3可以拮抗吉西他滨介导的肿瘤生长抑制和细胞凋亡；相反地,胰腺癌细胞敲除Pim-3的表达,对吉西他滨的细胞毒作用起到增敏效果。蛋白免疫印迹实验结果显示,吉西他滨诱导胰腺癌细胞Pim-3表达上调的同时,抗凋亡蛋白Bcl-XL和细胞周期相关分子Cdc25A、Cdc25C表达也增加。这些结果提示,Pim-3可能通过调节细胞增殖,细胞周期和凋亡,参与胰腺癌吉西他滨的耐药。3.间歇浓度递增法诱导的胰腺癌吉西他滨耐药细胞株,在体外细胞实验和体内裸鼠实验结果均显示,与亲本胰腺癌Miapaca-2细胞相比较,耐药细胞能够拮抗吉西他滨诱导的周期阻滞和细胞凋亡。RT-PCR和Western Blot实验结果显示吉西他滨耐药细胞株中Pim-3的mRNA以及蛋白水平表达均上调。敲除耐药细胞Pim-3表达后,耐药细胞对吉西他滨敏感性增加。蛋白免疫印迹实验结果显示,耐药细胞株Pim-3蛋白表达上调的同时,多药耐药基因编码的蛋白P-gp、抗凋亡蛋白分子Bcl-XL.细胞周期相关分子蛋白Cdc25A、Cdc25C表达也增加；敲除耐药细胞Pim-3表达后,P-gp、 Bcl-XL、Cdc25A、Cdc25C表达减少。这些结果进一步提示了,Pim-3通过调节细胞增殖,细胞周期和凋亡,参与胰腺癌吉西他滨的耐药。 [结论]1.Pim-3通过上调VEGF表达从而促进胰腺癌细胞体内生长和血管新生。2.吉西他滨能够诱导Pim-3mRNA和蛋白表达上调,进一步通过上调抗凋亡蛋白分子Bcl-XL和细胞周期相关分子Cdc25A, Cdc25C蛋白表达从而拮抗吉西他滨诱导的胰腺癌细胞凋亡和周期阻滞。3.间歇浓度递增法可以诱导Miapaca-2对吉西他滨耐药,成功建立耐药细胞株,在Miapaca-2细胞获得性耐药中Pim-3表达上调,并且通过促进P-gp表达和增加抗凋亡蛋白分子Bcl-XL、细胞周期相关分子蛋白Cdc25A、Cdc25C表达,诱导耐药细胞对吉西他滨的耐药。

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