摘要：

第一部分目的:肿瘤微环境是指在肿瘤生长进程中由肿瘤细胞和肿瘤间质细胞相互作用形成的有利于肿瘤细胞生长的特殊内环境.本研究旨在探讨微环境在乳腺癌干细胞培养鉴定分化过程中的影响及意义,借此模型为探究乳腺浸润性微乳头状癌(invasive micropapillary carcinoma, IMPC)的淋巴管侵犯,高淋巴结转移等恶性生物学行为及后续研究奠定基础.方法:采用原代培养的方法收集乳腺浸润性导管癌细胞作为实验组,MCF-7乳腺癌细胞系作为对照组,分别给予无血清培养液PCM-2及无血清培养液培养成纤维细胞的上清液培养,观察肿瘤细胞微球体形成的状况,借此模型来探讨乳腺浸润性微乳头状癌中微球体的形成机制及其临床意义.结果:1.形态学观察集团性细胞的直径及大小:利用无血清培养液PCM-2培养的原代细胞的微球体的直径大于用无血清培养液培养成纤维细胞的上清液培养的原代细胞(P=0.002),差异具有统计学意义.MCF-7中得到相似的结果.2.MTT比色法测定用两种不同培养液培养的原代细胞及MCF-7细胞的生长曲线:无血清培养液培养成纤维细胞的上清液培养的原代细胞及MCF-7细胞的生长速度均快于无血清培养液PCM-2培养.此外,无血清培养液PCM-2培养的MCF-7细胞的生长速度快于无血清培养液PCM-2培养的原代细胞,差异具有统计学意义(P=0.004).3.免疫细胞化学检测:将两种培养方法培养的原代细胞进行细胞爬片后,分别在细胞贴壁第1天及第5天时检测干细胞标记物ALDH1 (aldehyde dehydrogenase 1,ALDH1)的表达,结果发现无血清培养液PCM-2培养的原代细胞的ALDH1的表达率高于用无血清培养液培养成纤维细胞的上清液培养的原代细胞,且在无血清培养液PCM-2培养的原代细胞中ALDH1的表达率第1天高于第5天.于是推测在原代培养的乳腺癌细胞中可能存在少量的干细胞.4.实时定量PCR结果显示:与用无血清培养液培养成纤维细胞的上清液培养相比,无血清培养液PCM-2培养的MCF-7细胞系中,ALDH1,Oct-4的表达上调,E-cadherin的表达下调;同样,无血清培养液PCM-2培养的原代细胞中ALDH1的表达上调,E-cadherin的表达下调.结论:无血清培养能够富集乳腺癌干细胞,并且由肿瘤细胞本身,肿瘤间质细胞包括肿瘤相关T细胞,肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages, TAMs),肿瘤相关及纤维母细胞(carcinoma-associated fibroblasts,CAFs)等,微血管及各种细胞因子之间等共同组成的乳腺肿瘤微环境在肿瘤细胞的生长过程中发挥了至关重要的作用.第二部分目的:乳腺浸润性微乳头状癌(invasive micropapillary carcinoma, IMPC)是2003年WHO乳腺和女性生殖系统病理学与遗传学分类中新增的类型,是一种具有高淋巴管侵犯,高淋巴结转移等恶性生物学行为的特殊类型的乳腺癌.为了探究治疗乳腺癌的新方法,越来越多的研究者将焦点转移到肿瘤细胞和肿瘤间质细胞相互作用形成的微环境上.在肿瘤微环境中,TAMs扮演了十分重要的角色.本研究旨在探讨TAMs标记物CD68与CD163在IMPC中的表达及其临床意义.方法:采用免疫组织化学方法检测天津医科大学肿瘤医院乳腺病理研究室2006年1月至2007年12月间收检的经病理确诊的乳腺癌切除标本IMPC病例68例(纯型IMPC15例,IMPC伴IDC-NOS 53例),并随机选取同期诊断的72例浸润性导管癌非特殊型(invasive ductal carcinoma, not otherwise specified, IDC-NOS)病例作为对照组,观察TAMs标记物CD68与CD163在乳腺癌组织中的表达并结合临床病理学特征分析其表达与侵袭,转移及预后的临床意义.结果:1.CD163与CD68在IMPC与IDC-NOS中的癌巢内,瘤内间质和瘤周间质中均有表达.但仅瘤内间质中浸润的CD68+TAMs在两组间的差异具有统计学意义(P=0.022).2. IMPC中瘤内间质CD68的阳性表达率(47/68,69.1%)高于IDC-NOS(37/72,51.5%),且IMPC中瘤内间质CD68的阳性表达率与组织学分级(P=0.024),淋巴结转移(P=0.019),病理学分期(P=0.009),脉管侵犯(P=0.004),Ki-67(P=0.016)的表达呈正相关,与ER的表达呈负相关(P=0.037).3. IMPC中CD68与CD163在瘤周间质(63/68,92.6%;65/68,95.6%)的表达均高于瘤内间质(47/68,69.1%,29/68,42.6%),差异均具有明显的统计学意义(rs=0.508,P0.001;rs=0.462,P0.001).瘤内间质CD68(47/68,69.1%)的表达高于CD163(29/68,42.6%),癌巢内CD68(13/68,19.1%)的表达高于CD163(11/68,16.2%),差异均有统计学意义(rs=0.529,P0.001;rs=0.908,P0.001).4. Kaplan-Meier单因素生存曲线分析显示:瘤内间质CD68的表达与无进展生存期(progression free survival, PFS)呈负相关(P=0.027),与总生存期(overall survival, OS)无明显相关性(P=0.188),而瘤周间质及癌巢内CD68的表达与PFS及OS均无明显相关性.结论:1.IMPC中瘤内间质CD68的表达率高于IDC-NOS,且瘤内间质CD68的表达与高组织学分级呈正相关,与ER的表达呈负相关.2.IMPC组瘤内间质CD68的表达与其高淋巴结转移,脉管侵犯呈正相关.我们的前期研究中IMPC间质微血管密度的表达显著高于IDC-NOS,且与淋巴结转移呈正相关.可能是TAMs产生的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),基质金属蛋白酶(MMP-9)和免疫调节因子(如IL-10)等改变微环境继而促进IMPC间质中新生血管的形成,淋巴结的转移及脉管的侵袭.3.本研究发现Ki67的高表达与瘤内间质CD68的表达呈正相关(P=0.016).推测IMPC肿瘤细胞分泌的各种因子能够招募TAMs,TAMs分泌的表皮生长因子等进而促进细胞的增殖与IMPC的进展.4.IMPC中瘤内间质CD68的高表达与PFS呈负相关,可能有助于开发潜在的治疗乳腺癌的免疫靶标.

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