摘要：

目的:探讨BVES对P19CL6心肌细胞分化及增殖的作用及其机制,为先天性心脏病的发病机制奠定一定的理论基础。方法:实验采用P19Cl6细胞体外心肌细胞分化模型、1%DMSO可诱导其分化为成熟跳动的心肌细胞。含BVES基因片段的质粒过表达P19CL6细胞上调内源性BVES表达,BVES特异性si RNA转染P19CL6细胞沉默内源性BVES表达。q RT-PCR实验定量检测转录因子(Gata4、Nkx2.5、Tbx5)、心脏基因(MYH6、MYL7)、目的基因BVES和Rho A的m RNA表达水平,western blotting定量检测心肌肌钙蛋白(c Tn T)蛋白水平表达,免疫荧光检测心肌骨架蛋白MF20和Actinin蛋白水平表达。CCK-8实验检测细胞数量、Ed U实验检测细胞DNA合成、细胞流式检测细胞周期。结果:成功构建P19CL6细胞体外心肌细胞分化模型,P19CL6细胞在含1%DMSO培养基诱导分化12天后,免疫荧光染色显示心肌细胞骨架蛋白Actinin阳性细胞明显增多,q RT-PCR显示心脏转录因子(Gata4、Nkx2.5、Tbx5)及心脏基因(MYL7、MYH6)的m RNA表达在P19CL6心肌细胞分化过程表达逐渐升高。BVES表达在P19CL6细胞心肌细胞分化过程被诱导表达。BVES质粒可上调P19CL6细胞内源性BVES蛋白和m RNA表达,BVES特异性si RNA可有效抑制P19CL6细胞内源性BVES蛋白和m RNA表达。免疫荧光染色结果显示过表达BVES可减少P19CL6心肌细胞分化数量,q RT-PCR结果显示过表达BVES抑制P19CL6心肌分化转录因子(Gata4、Nkx2.5、Tbx5)及心脏基因(MYL7、MYH6)m RNA表达,western blotting结果显示过表达BVES抑制心肌细胞分化晚期心肌肌钙蛋白(c Tn T)蛋白表达。免疫荧光染色结果显示沉默BVES表达可增加P19CL6向心肌细胞分化数量,q RT-PCR结果显示沉默BVES促进P19CL6心肌分化心脏基因(MYL7、MYH6)m RNA表达,但对P19CL6心肌细胞分化过程心脏转录因子(Gata4、Nkx2.5、Tbx5)表达无影响,western blotting结果显示沉默BVES表达可促进分化晚期心肌肌钙蛋白(c Tn T)蛋白表达。流式细胞学实验显示过表达BVES可抑制心肌细胞周期循环、使心肌细胞保持在G0/G1期,Ed U结果显示过表达BVES抑制心肌细胞DNA合成,CCK8结果显示过表达BVES可减少心肌细胞增殖,但沉默BVES表达对心肌细胞周期循环、DNA合成、细胞增殖无影响。心肌细胞过表达BVES可抑制Rho A表达,沉默BVES可促进Rho A表达。沉默Rho A表达可逆转BVES调节P19CL6心肌细胞分化效应,但对BVES调节心肌细胞增殖效应无影响。结论:BVES在P19CL6细胞心肌分化过程高表达,BVES负性调节P19CL6心肌细胞分化和心肌细胞增殖,且通过Rho A调节P19CL6心肌细胞分化。

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