摘要：

海洋微生物物种丰富,生态功能多样,其代谢产物往往具有新颖的结构及显著的生物活性,是先导化合物及新药的重要来源。作为海洋微生物的重要组成部分,曲霉属真菌(Aspergillus sp.)能够产生多种结构类型和生物活性的次级代谢产物,作为活性天然产物的重要来源之一引起了人们极大的关注。生物信息学分析表明真菌中存在大量次级代谢产物生物合成基因簇(Biosynthetic Gene Clusters,BGCs),仅曲霉属和青霉属真菌所含BGCs至少为25000个,具有丰富的次级代谢产物合成潜力。如何运用传统分离方法挖掘更多活性代谢产物,以及在基因组信息指导下运用生物学手段激活这些生物合成基因簇具有很大的研究价值和研究意义。本文从海蟑螂肠道内分离得到三株曲霉属(Aspergillus sp.)真菌Z3、Z4和Z5,对这三株真菌进行了系统的次级代谢产物研究,运用OSMAC(One Strain Many Compounds)策略从其发酵物中分离了 34个化合物,包括9个新化合物,以及1个首次从真菌代谢产物中发现的化合物。对分离得到的细胞松弛素类衍生物和吲哚二酮哌嗪二聚体类衍生物进行了初步的抗肿瘤活性、抑菌活性以及神经保护活性测试。从真菌Z5中分离得到的次级代谢产物类型较单一,远低于前期该菌株的生物合成基因簇预测结果,本文选择Z5基因组中一个NRPS-like类型的基因簇作为研究对象,尝试以构巢曲霉Aspergillus nidulans为宿主,对该基因簇进行异源表达,丰富菌株Z5的次级代谢产物类型,探索真菌Z5更多的应用价值。采用OSMAC策略丰富曲霉属真菌Z4的次级代谢产物,从其2216E液体培养基和大米培养基中分离了 17个化合物,包括13个细胞松弛素类衍生物(1~13)及4个二酮哌嗪类化合物(14~17),其中化合物1~5为新化合物,化合物1和2为新骨架化合物。化合物12对人前列腺癌细胞PC3具有显著的细胞毒活性,IC50为11.14μM,化合物9对PC3细胞生长具有中等抑制作用,IC50为31.72 μM。从曲霉属真菌Z3中分离鉴定了 8个化合物,包括一个茚酮类化合物(18),四个吲哚二酮哌嗪二聚体类衍生物(19~22),一个麦角甾醇类化合物(23),一个间苯二酚(24),一个二肽类化合物(25)。其中化合物18为新化合物,化合物20~22为化合物19的立体异构体,也是新化合物。运用比较ECD和计算ECD法、NOESY谱、X-ray单晶衍射、Marfey法等多种方法,确定了化合物18及化合物20~22的绝对构型。在基因组信息指导下,选择真菌Z5基因组中一个NRPS-like类型的基因簇(cluster 24)为研究对象,以构巢曲霉A.nidulans为宿主对其进行异源表达,并将骨架基因g8094的启动子替换为强启动子gpdAp;同时,对Z5野生株进行改造,将诱导型强启动子alcAp插入g8094之前,成功构建Z5突变株。RT-PCR及相对定量q-PCR结果显示更换强启动子之后骨架基因g8094表达量虽有提高,但整体表达量依然较低,修饰基因表达量较低或没有表达,尚未挖掘出该基因簇编码的代谢产物。

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