摘要：

人白细胞相关免疫球蛋白样受体1(1eukocyte-associatedimmunoglobulin-likereceptor-1,LAIR-1)是1997年基因克隆成功的分子,在2004年底举行的第八届国际人类白细胞分化抗原大会上获准了新的CD编号(CD305).自从1983年发现该分子以来,已证明其是与免疫功能密切相关的抑制性受体,能够抑制多种免疫细胞的功能.研究发现,LAIR-1具有广泛的组织分布,并在造血细胞的分化,增殖中起重要的调节作用,是一个具有重要生物学功能及临床潜在应用前景的分子. 小鼠LAIR-1(murineLAIR-1,mLAIR-1)是人LAIR-1(humanLAIR-1,hLAIR-1)基因在小鼠体内的同源物,其序列在氨基酸水平与人LAIR-1分子有40%同源性,2002年我室首次从小鼠胸腺中成功克隆该基因(GenBankAF479685).小鼠LAIR-1基因位于小鼠7号染色体上,共编码263个氨基酸,胞膜外区也含有1个免疫球蛋白(Ig)样结构域,故属于免疫球蛋白超家族(IgSF)成员,胞质区含有2个ITIM(immunoreceptortyrosine-basedinhibitorymotif)样基序.探讨LAIR-1在人与鼠表达的异同点,有助于对该分子生物学功能的进一步认识,也有助于了解其在生物进化过程中所发生的变化.本博士论文是基于hLAIR-1分子研究的基础上,对mLAIR-1分子的表达,分布及其功能进行了初步的研究. 抗体是新分子分布和功能研究的有力工具,由于针对小鼠胞膜分子鼠源性单克隆抗体(monoclonalantibody,mAb)制备的成功率较低,到目前为止国内外仍未有商品化的针对mLAIR-1的mAb,因此凸显出制备高质量的多克隆抗体(polyclonalantibody,PoAb)的重要性.为此,我们首先构建了表达mLAIR-1-Fc融合蛋白的载体,转染CHO细胞,建立了稳定表达mLAIR-1-Fc融合蛋白的细胞株,用proteinA亲和层析柱纯化mLAIR-1-Fc融合蛋白.然后用融合蛋白交联CNBr-Sepharose4B凝胶制备成亲和层析柱,从免疫兔血清中纯化针对小鼠LAIR-1的多克隆抗体,通过纯化,获得纯度高,特异性强的多克隆抗体.ELISA和SDS-PAGE鉴定结果表明该抗体具有良好的生物学活性和较高的纯度.经间接免疫荧光染色,FCM和Westernblot分析,该抗体能识别mLAIR-1分子,证实我们制备的兔抗mLAIR-1胞外区的抗体具有良好的特异性和生物学活性,为下一步的研究工作奠定了基础. 采用间接免疫荧光染色,对多种细胞系进行流式细胞术分析并观察mLAIR-1的分布发现,LAIR-1的分布及表达水平随细胞系的不同而变化,以小鼠成纤维细胞系和髓样细胞系表达水平最高. 免疫荧光染色及免疫组化结果提示,mLAIR-1参与了中枢免疫器官和外周免疫器官的造血等过程.免疫荧光染色显示,在中枢免疫器官中,mLAIR-1在骨髓B细胞上表达水平较高,并可能参与了胸腺T细胞的发育过程;在脾脏中,相对T细胞来讲,成熟的B细胞,NK细胞和巨噬细胞上mLAIR-1表达水平较高.免疫组化结果显示,mLAIR-1在胸腺不成熟的皮质区中有散在的分布,而在皮髓质交界处以及髓质区有较明显的表达.在脾脏中,mLAIR-1主要表达在红髓,白髓也有一定水平的表达. T细胞在胸腺中发育成熟,这一过程依赖于胸腺的微环境.调控胸腺细胞正常发育的微环境包括两个方面,一是来自胸腺基质细胞分泌的细胞因子和激素,二是通过黏附分子的相互作用为胸腺细胞提供活化或抑制的信号.胸腺细胞膜分子与胸腺微环境基质细胞相应配体相互作用调节胸腺细胞发育的研究日益受到重视.我们利用胸腺器官培养(fetalthymusorganculture,FTOC)实验模型,用mLAIR-1融合蛋白在体外干预胎鼠胸腺的发育,观察到加入mLAIR-1-Fc融合蛋白后,胸腺细胞总数明显增加,细胞各亚群的数目也发生了变化,尤其是CD4+CD8+双阳性细胞亚群增长最为明显. 以小鼠LAK(lymphokine-activatedkillercells)细胞为模型,采用重导向杀伤试验(redirectedcytotoxicityassay,RCA)证实了mLAIR-1分子在小鼠体内起抑制杀伤的作用. 采用Westernblot鉴定了三种小鼠重要的磷酸酶SHP-1,SHP-2和SHIP的mAb,并用FPLC阴离子交换层析纯化了该系列mAb.利用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP)的方法检测到mLAIR-1募集的磷酸酶可能是SHP-2. 大多数白细胞分化抗原在生物进化中具有保守性,这是不同种属动物执行相同或相似生物学功能的需要.小鼠是免疫学研究中最常用的实验动物,而且对某些人白细胞分化抗原的结构和功能的了解首先是从小鼠或小鼠源性的细胞实验模型中得知的,所以我们对mLAIR-1分子的研究为进一步了解LAIR-1分子的功能提供了重要的实验依据.

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