摘要：

目的:肝纤维化是许多肝脏疾病发展成为肝硬化的重要病理过程,目前还没有疗效良好的治疗药物.本课题研究积雪草酸对胆汁性肝纤维化小鼠的治疗作用,并探讨积雪草酸的作用机制,为其应用于肝纤维化的治疗提供实验依据. 方法:本研究通过胆管结扎(BDL)诱导小鼠肝损伤及肝纤维化建立在体实验模型,并以甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC)处理 HL-7702细胞建立体外肝损伤模型,通过在体和离体实验探讨积雪草酸的抗肝纤维化作用及机制. 在体实验:结扎C57小鼠的总胆管,建立淤胆型肝损伤模型,分为假手术对照组,模型组,积雪草酸15 mg/kg组和30 mg/kg组,每组6只.各组小鼠连续灌胃给药5天.测定血清生化指标水平来检测肝功能.称量小鼠肝脏及脾脏组织,并计算肝脏指数和脾脏指数.检测肝组织内 MDA(丙二醛),SOD(超氧化物气化酶)和 Catalase(过氧化氢酶)和 GSH(还原型谷胱甘肽)分析小鼠肝组织氧化应激.将肝脏组织切片H&E染色,Masson染色进行病理学检查, TUNEL染色检测肝细胞凋亡;α-SMA(α-平滑肌肌动蛋白)免疫组化及 Western blot检测肝纤维化程度.采用实时荧光定量 PCR测定炎症因子及肝纤维化因子相关基因的 mRNA水平,分析积雪草酸对炎症,肝纤维化的改善作用;测定胆汁酸代谢相关的基因表达水平,分析胆汁酸代谢调节途径.Western blot法检测Bax,Bcl-2的表达水平,分析积雪草酸的抗凋亡机制;检测核因子 E2相关因子2(Nrf2),血红素氧合酶-1(HO-1)的蛋白表达水平,研究积雪草酸的抗氧化机制. 离体实验:采用 GCDC作用于 HL-7702细胞建立体外肝损伤模型,分为对照组,模型组和不同浓度的积雪草酸处理组,MTT法检测细胞活性,Annexin V/PI双染法通过流式细胞仪检测细胞凋亡,DCFH-DA荧光探针法检测细胞中活性氧(ROS)的含量,细胞免疫荧光和蛋白免疫印迹法检测 Nrf2的蛋白表达水平. 结果:在 BDL小鼠模型中,我们发现 BDL模型组小鼠肝脏肿大,欠光泽,肝组织出现胶原沉积,炎性细胞浸润的现象,积雪草酸给药后能够改善 BDL小鼠的肝组织形态和病理特征,降低肝脏指数和脾脏指数.BDL模型组小鼠血清中天冬氨酸转氨酶(AST),丙氨酸转氨酶(ALT),碱性磷酸酶(AKP),羟脯氨酸(Hyp),总胆固醇(T-CHO),总胆红素(TBIL)和总胆汁酸(TBA)的水平显著上升,积雪草酸给药能够显著降低这些生化指标的水平,高剂量效果更明显.同时,积雪草酸能够减少肝组织α-SMA的表达;降低纤维化因子Ⅲ型胶原蛋白(Col3a1),波形蛋白(Vim),肌动蛋白(Acta2),转化生长因子(TGF-β1) mRNA的表达水平;降低促炎因子包括前列腺素内过氧化物合成酶2(Pgst2),IL-6,TNF-α,趋化因子配体3(CCL3)的 mRNA表达水平.积雪草酸给药作用后,上调 Bcl2,下调 Bax表达,减少肝组织细胞的凋亡.积雪草酸给药能够抑制 BDL小鼠肝组织的氧化应激水平,表现为 MDA含量的降低,SOD,GSH和 Catalase水平的提高,促进 Nrf2和 HO-1的蛋白表达.此外,积雪草酸给药能够调控 BDL小鼠的胆汁酸代谢途径相关基因,法尼酯 X受体(FXR),胆固醇7α-羟化酶(CYP7α1),小分子异源二聚体伴侣(SHP),成纤维细胞生长因子(FGF15)的 mRNA水平,减少肝组织内胆汁酸淤积. 离体实验表明积雪草酸能够有效的保护 GCDC诱导的 HL-7702细胞损伤.实验结果显示,积雪草酸处理可以显著增加细胞存活率(P<0.001);减少细胞内ROS生成,降低细胞凋亡率,抑制作用均呈浓度依赖性增强;促进HL-7702细胞表达 Nrf2蛋白. 结论:在体实验水平,积雪草酸具有显著改善 BDL鼠肝纤维化的作用,抑制氧化应激,抑制炎症反应,调控胆汁酸代谢,改善肝组织形态和功能;在细胞水平上,积雪草酸对抗 GCDC诱导的 HL-7702细胞损伤,抑制 ROS的增加,减少细胞凋亡,促进 Nrf2的表达.本论文研究结果揭示积雪草酸有改善胆汁性肝纤维化的作用,其机制可能与抗凋亡以及 Nrf2介导的抗氧化和调控胆汁酸代谢有关.

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