摘要：

本项目以山杏(Prunus armeniaca L. var. ansu Maxim.)仁蛋白为研究对象,用五种酶水解山杏仁蛋白,研究山杏仁蛋白酶水解物对脂多糖诱导巨噬细胞产生一氧化氮(NO)的影响;用超滤技术分离不同分子量的山杏仁蛋白酶水解物,比较不同分子量肽段对NO产生的抑制作用,确定活性肽分子量范围;用Nano-LC-ESI-MS/MS技术配合NCBI数据库资料和格里斯NO检测实验,鉴定活性肽结构;通过检测·OH,MDA,SOD及GSH-Px等指标,初步研究活性肽抑制NO产生的机理.主要研究结果如下:(1)用木瓜蛋白酶,胃蛋白酶,胰蛋白酶,中性蛋白酶及碱性蛋白酶等五种酶对山杏仁蛋白进行水解,通过格里斯实验,研究山杏仁蛋白酶水解物对脂多糖诱导巨噬细胞产生NO的影响,结果表明木瓜酶水解物具有显著抑制脂多糖诱导NO异常增生作用.在500 μg/mL浓度下,山杏仁蛋白木瓜酶水解物可以将LPS诱导下产生的NO量由31.2μM降低至12.0μM,降低了75%.因此,以下研究集中在山杏仁蛋白的木瓜酶水解物,简称山杏仁蛋白酶水解物.(2)通过单因素试验结合(L9(3)4)正交试验,以抑制NO产生作用为指标,优化木瓜蛋白酶水解山杏仁蛋白的工艺条件,确定具有较强抑制NO产生作用的山杏仁蛋白酶水解物的制备工艺条件为:水解温度(T)60℃,水解时间(time) 3h,底物浓度(S)5%,酶底物比(E/S)10%.(3)采用超滤方法,按分子量不同,将山杏仁蛋白酶水解物分离为10kDaMW3kDa,3kDaMW1kDa,MW1kDa等三个组分,通过格里斯实验,比较三组分对脂多糖诱导下巨噬细胞产生一氧化氮的影响,结果表明MW1kDa较低分子量组分具有较强的抑制一氧化氮异常增生作用.在500 μg/mL浓度下,可将异常增生的NO由31.2μM降低至6.1 μM,即正常对照110%水平.(4) Nano-LC-ESI-MS/MS技术配合NCBI数据库资料,发现MW1kDa的低分子量山杏仁蛋白酶水解物中含有16个肽段.用计算机模拟分子对接技术,以与诱导型一氧化氮合酶(NOS)对接的自由结合能的大小为指标,筛选出与iNOS活性中心结合较紧密的两个肽,分别是DMTEEF和FEAYEF.(5)通过格里斯实验验证DMTEEF和FEAYEF抑制NO异常增生作用,结果表明DMTEEF和FEAYEF在50-100 μg/mL浓度水平,可将异常增生的NO降低至正常对照的100%.(6)检测·OH,MDA,SOD及GSH-Px等指标的抗氧化实验结果表明,DMTEEF和FEAYEF能将LPS诱导巨噬细胞产生·OH水平,由相对于正常对照组的153%分别降低至98%和101%;MDA水平分别由142%分别降低至100%和93%;SOD水平由52%分别恢复至99%和99.5%;GSH-Px水平由66%分别恢复至90%和81%.以上结果表明,山杏仁蛋白在水解温度(T)60℃,水解时间(time) 3h,底物浓度(S)5%,酶底物比(E/S)10%的工艺条件下,经木瓜酶水解能够释放抑制LPS诱导巨噬细胞异常增生NO的两种活性肽DMTEEF和FEAYEF,其作用机制与活性肽的抗氧化作用具有密切关系.

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