摘要：

第一部分 宫内发育迟缓对大鼠血压及肾功能的影响 背景 近年来,大量流行病学资料显示,宫内发育迟缓(IUGR)与成年期疾病如高血压,2型糖尿病,冠心病以及慢性肾病等密切相关,提示宫内环境,甚至生后早期环境,可能通过"发育程序化"途径,增加子代发生某些成年期疾病的危险性.但是目前具体的机制尚未阐明.我们选用孕期全程低蛋白饮食法建立IUGR大鼠模型,动态观察IUGR对大鼠血压以及肾脏结构和功能的影响,探讨宫内环境对成年期高血压和肾脏疾病的作用. 方法 雌性SD大鼠,孕期全程低蛋白(6%蛋白)营养,建立IUGR大鼠模型,并且设立正常对照.选取IUGR雄鼠作为研究对象.选择4周,8周,12周龄作为动态观察节点,通过尾动脉测量仪测定大鼠血压;常规生化方法测定24小时尿蛋白定量.12周龄时利用酸消化方法计数肾小球数目;对氨基马脲酸清除率法观察有效肾血浆流量(RPF);菊粉清除率观察肾小球滤过率(GFR). 结果 IUGR模型组新生鼠出生体重明显低于正常新生鼠(6.92±0.33g vs.4.81±0.27g,P<0.001).与正常对照组相比,IUGR大鼠单侧肾脏肾小球数目下降了约21%(22900±926个vs.28861±1044个,P<0.01);在8周龄时出现高血压(125.2±2.3mmHg vs.109.4±3.1mmHg,P<0.01),并且血压的增高至12周时更为明显(132.1±2.9mmHg vs.115.2±2.3mmHg,P<0.01);12周龄时出现了肾重/体重的增加(0.378±0.019%vs.0.334±0.007%,P<0.05)和轻度的蛋白尿(118.46±21.85 mg·kg~(-1)·d~(-1)vs.69.72±10.35 mg·kg~(-1)·d~(-1),P<0.05),而GFR和RPF没有明显差异(P均>0.05). 结论 我们的实验结果提示,在大鼠孕期低蛋白营养所致的IUGR可以引起高血压的发生,并且肾单位数目的减少可能是程序化高血压的机制之一. 第二部分 宫内发育迟缓引起肾单位数目减少的机制研究 背景 人类研究及多项动物实验均证实宫内发育迟缓(IUGR)与肾单位数目减少明显相关,但是目前机制未明.肾脏发育包含快速的结构重建,尤其在后肾阶段.这个过程需要大量的细胞增殖和凋亡,并且受到多种相关基因的严格调控,如Wilms瘤1基因(WT1),Bcl-2,Bax和p53等.因此,本研究拟于观察IUGR是否通过影响肾发生中细胞增殖和凋亡及其关键因子的表达,引起肾单位数目减少的发生. 方法 采用孕期全程低蛋白(6%蛋白)营养建立IUGR大鼠模型.选取IUGR新生雄鼠作为研究对象,采用Ki-67免疫染色和TUNEL法检测肾组织细胞的增殖和凋亡;实时定量PCR测定肾组织WT1,Bcl-2,Bax及p53的mRNA表达水平;Western blot方法检测肾组织中WT1和Bcl-2蛋白质表达.2周龄(肾发生完成)时测定肾单位数目. 结果 2周龄时,IGUR大鼠肾单位数目明显少于对照组(22891±1242个vs.28466±919个,P<0.001).与对照组相比,IUGR新生鼠肾脏皮质区明显较薄(391.94±24.73μm vs.425.50±24.01μm,P<0.01),生肾区占总皮质区厚度的百分比明显增高(38.1±3.4%vs.24.3±6.7%,P<0.01);生肾区TUNEL阳性细胞数明显增多(21.26±1.94%vs.12.14±1.96%,P<0.001);肾脏WT1,Bel-2 mRNA表达减少(4.96+0.17 vs.5.33+0.22,4.28+0.14 vs.4.46+0.11,P均<0.01),Bel-2mRNA/Bax mRNA的比例降低(0.739±0.022 vs.0.770±0.030,P<0.05),而p53mRNA的表达没有差异(P>0.05);肾组织中WTl和Bel-2蛋白质的表达量也明显减少(0.364±0.015 vs 0.554±0.053,0.573±0.022 vs.0.914±0.059,P均<0.001). 结论 IUGR大鼠肾单位数目减少可能与肾发生中细胞凋亡增加相关,而WT1,Bel-2表达减少,Bel-2/Bax比例降低可能是细胞凋亡增加的分子机制之一. 第三部分 生后高蛋白营养干预对宫内发育迟缓大鼠肾脏的影响 背景 既往认为,对宫内发育迟缓(IUGR)儿生后给予高蛋白饮食,将有助于体格的快速增长.但是近来,有人提出"预计的适应性改变"(predictive adaptive response,PAR)理论,认为产前环境与产后环境的不匹配,可以增加继发成年期疾病的危险性.并且,高蛋白本身可以引起肾小球高灌注,高滤过,引起肾脏损伤的进一步加重.因此,本部分实验我们设计产前,产后差异环境,观察高蛋白营养对IUGR大鼠肾脏发育及肾功能的影响. 方法 采用孕期全程低蛋白(6%蛋白)营养建立IUGR大鼠模型.选取IUGR新生雄鼠作为研究对象,生后分别给予常规饲料(22%蛋白)(IUGR组)和高蛋白饲料(30%)(HP组)喂养,同时设立正常对照(Con组).选择4周,8周,12周龄作为动态观察节点,通过尾动脉测量仪测定大鼠血压;常规生化方法测定24小时尿蛋白定量.12周龄时利用酸消化方法计数肾小球数目;光镜和电镜观察肾组织形态;实时定量PCR测定肾皮质desmin mRNA表达水平. 结果 12周龄时,与IUGR组相比,HP组大鼠肾小球数目未见增加(23043±595个/单侧肾脏vs.22900±926个/单侧肾脏,P>0.05),但是高血压和蛋白尿的程度均明显增加(138.6±2.8mmHg vs.132.1±2.9mmHg,P<0.01;202.61±62.55mg·kg~(-1)·d~(-1) vs.118.46±21.85,P<0.001).PAS染色显示HP组大鼠肾小球细胞外基质较Con组明显增多(31.6±2.3%vs.21.3±2.1%,P<0.01).电镜显示,IUGR组大鼠仅见少量足细胞足突融合;而HP组大鼠呈现明显的系膜细胞增生,足突部分融合.IUGR和HP组大鼠肾皮质desmin mRNA表达量均明显高于Con组(IUGR组:3.33±0.41,HP组:4.06±0.27 vs.Con组:2.77±0.37,P均<0.05):且HP组的表达增加较IUGR组更为明显(P<0.05). 结论 IUGR大鼠生后给予高蛋白饮食干预,不仅不能纠正肾单位数目的减少,而且加重了高血压和蛋白尿的严重程度.足细胞损伤可能是IUGR和生后高蛋白饮食引起蛋白尿的机制之一.

展开