DMOG对鼠BMSCs凋亡与成骨分化影响及在兔激素性股骨头坏死修复中作用的实验研究

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作者:

张磊

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摘要:

目的 脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylase,PHD)是低氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)降解过程中的限速酶,而脯氨酸羟化酶抑制剂(proline hydroxylase inhibitor, PHI)能抑制PHD活性从而抑制HIF降解和稳定HIF蛋白,人工模拟低氧环境,我们称之为化学性低氧.二甲基乙二酰基甘氨酸(dimethyloxalylglycine,DMOG)属于酮戊二酸类似物类脯氨酸羟化酶抑制剂,也能抑制HIF降解而稳定HIF蛋白.激素性股骨头缺血性坏死(steroid-induced avascular necrosis of femoral head,SANFH)发病率呈逐年上升趋势,居非创伤性ANFH的首位.目前尚无有效方法逆转该病理过程,最终可能还是不得不进行全髋关节置换术.本实验第一部分在体外研究DMOG对缺血清培养小鼠BMSCs凋亡的抑制作用,以及对Bcl-2/Bax蛋白表达的影响,探讨DMOG对BMSCs凋亡对抗作用及可能的分子机制;第二部分在体外研究DMOG对小鼠BMSCs成骨分化的促进作用,并研究在此成骨分化过程中RhoA/ROCK信号通路中关键蛋白的表达情况,从而探讨DMOG促进BMSCs成骨分化的分子机制;第三部分主要研究DMOG/兔骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)/生物蛋白胶(fibrin glue,FG)三者复合物经髓芯减压植入激素性股骨头坏死的兔股骨头局部后的修复作用.旨在通过上述研究为进一步探讨DMOG对SANFH的修复作用,为进一步体内实验及临床应用奠定基础. 方法 第一部分:采用小鼠股骨与胫骨全骨髓及贴壁法分离培养小鼠骨髓单个核细胞,利用流式细胞仪和细胞的成骨,成脂,成软骨的三系分化鉴定骨髓单个核细胞.利用缺血清培养法在体外建立BMSCs凋亡模型,利用流式细胞仪TUNEL法检测DMOG对BMSCs缺血清培养凋亡的干预效果,Hoechst染色法观察细胞核的形态变化.Western blot法检测常氧培养条件下,1%低氧培养条件下及常氧条件并DMOG干预下HIF-1a蛋白表达情况.Western blot法检测DMOG对细胞Bcl-2/Bax蛋白表达影响. 第二部分:研究DMOG对BMSCs成骨分化的影响.使用MTT法检测不同浓度DMOG对BMSCs增殖的影响;通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)定量测定检测不同浓度DMOG对BMSCs成骨分化ALP表达的影响,以此确定促进BMSCs成骨分化的DMOG最适浓度;并进一步通过Real-time PCR法检测该最适浓度DMOG (0.5mM DMOG)对细胞RUNX2,Osterix的mRNA表达的影响,Western blot检测最适浓度DMOG (0.5mM DMOG)对细胞RUNX2蛋白的表达的影响,偶氮法染色检测最适浓度DMOG (0.5mM DMOG)对BMSCs成骨分化中ALP表达影响及茜素红染色检测最适浓度DMOG (0.5mM DMOG)对BMSCs成骨分化中钙离子沉积的影响:使用Western Blot法检测最适浓度DMOG (0.5mM DMOG)对BMSCs成骨分化中RhoA/ROCK信号通路关键分子total-RhoA,active-RhoA,ROCK1,p-cofilin蛋白表达的影响,鬼笔环肽染色检测最适浓度DMOG (0.5mM DMOG)对BMSCs细胞骨架蛋白重排的影响,划痕试验用以检测最适浓度DMOG (0.5mM DMOG)对BMSCs迁移能力的影响.使用RhoA/ROCK信号通路特异性抑制剂-10μM Y-27632干预细胞后,再次使用ALP检测试剂盒检测ALP表达情况,茜素红染色了解钙离子沉积及鬼笔环肽染色检测细胞骨架蛋白排列情况. 第三部分:采用双次注射大肠杆菌内毒素加三次注射甲基强的松龙方法建立兔激素性股骨头坏死模型,并于末次注射后12周通过HE染色,X线及MRI检查确认造模效果.取造模成功后并存活的新西兰大白兔20只,随机分为4组,每组5只:A组:阴性对照组(单纯造模组);B组:单纯髓芯减压组(造模后仅行髓芯减压);C组:髓芯减压+BMSCs生物蛋白胶复合物移植;D组:髓芯减压+DMOG+BMSCs生物蛋白胶复合物移植.于手术后12周通过MRI检查及VEGF,RUNX2免疫组化染色了解股骨头局部成血管与成骨效应. 结果 第一部分:流式细胞仪检测细胞表面标记结果显示我们分离的骨髓单个核细胞CD90(+),CD105(+),CD44(+),CD34(-),其三系分化后茜素红染色(+),油红O染色(+),甲苯胺蓝染色(+).流式细胞仪TUNEL法细胞凋亡检测表明:与对照组相比,缺血清培养组细胞凋亡率明显增加(P<0.05);与缺血清培养组相比,DMOG干预组细胞凋亡率明显下降(P<0.05).Hoechst染色结果表明DMOG能够明显改善BMSCs因缺血清培养所造成的细胞核形态改变.Westernblot结果表明在常氧培养条件下1mM DMOG明显上调HIF-1α蛋白表达量(P<0.05);与缺血清培养组相比,DMOG能明显上调Bcl-2表达而下调Bax表达(P<0.05). 第二部分:MTT结果表明DMOG能以剂量依赖的方式抑制BMSCs的增殖.与对照组相比,0.5mM DMOG对BMSCs增殖无明显抑制作用(P>0.05),且0.5mM DMOG能明显上调BMSCs的ALP表达(P<0.05);与对照组相比,0.5mM DMOG能够上调RUNX2,Osterix mRNA表达,上调RUNX2蛋白表达及ALP表达(P<0.05),并且增强细胞ALP染色及茜素红染色效果.Western blot检测结果提示0.5mM DMOG能够明显上调total-RhoA,active-RhoA,ROCK1,p-cofilin蛋白的表达:鬼笔环肽染色结果表明0.5mM DMOG能够明显导致细胞骨架纤维形态的改变.采用ROCK特异抑制剂Y-27632与DMOG共同作用后,细胞内ALP表达被抑制(P<0.05),钙结节减少,细胞骨架纤维形态改变不明显. 第三部分:末次注射甲强龙12周后,HE染色见成骨细胞明显减少,骨细胞坏死;X线示髋关节间隙明显狭窄;MRI是股骨头信号减低.经髓芯减压及细胞移植手术后12周,MRI检测表明A组信号减低范围扩大并且股骨头有轻微塌陷;B组信号仍降低但好于A组,股骨头外形无明显异常;C组股骨头信号仍然有降低但好于B组,股骨头外形无异常;D组股骨头信号有轻微降低,明显好于B组与C组.VEGF及RUNX2免疫组化监测结果显示术后12周A组VEGF与RUNX2均为阴性表达,B组和C组VEGF与RUNX2均为弱阳性表达,D组VEGF与RUNX2为强阳性表达. 结论 1. DMOG能对抗小鼠BMSCs因缺血清培养引起的凋亡;对凋亡调控蛋白Bcl-2/Bax表达比率的调控可能是DMOG对抗BMSCs缺血清凋亡的机制之一. 2. DMOG能以剂量依赖的方式抑制BMSCs的增殖;DMOG能够促进BMSCs成骨分化;DMOG通过激活RhoA/ROCK信号通路促进BMSCs成骨分化. 3.双次注射大肠杆菌内毒素加三次注射甲基强的松龙能够成功建立兔激素性股骨头坏死模型;DMOG/BMSCs/FG复合物经髓芯减压植入到股骨头局部能够促进股骨头局部的成骨与成血管反应,进而促进股骨头坏死修复.

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学位级别:

博士

学位年度:

2013

被引量:

3

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来源学校

昆明医科大学

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