摘要：

胰腺癌是最具侵袭性的恶性肿瘤之一,在世界范围内胰腺癌是癌症相关死亡的重要原因.胰腺癌诊断后五年生存率仅约4%,80%～85%的胰腺癌患者在确诊时已经无法接受手术治疗或者已经发生转移,导致了其较差的预后和较低的生存率.对于局部晚期或转移性胰腺癌患者,以吉西他滨为基础的联合化疗是主要的治疗方式,然而大多数胰腺癌患者会对吉西他滨产生耐药,这是导致胰腺癌化疗失败的重要原因.因此,迫切需要开发新型药物来治疗胰腺癌. 既往的基础研究和临床试验证明许多由传统中草药提取的自然物质如喜树碱,长春花碱是有效抗肿瘤药物,而这些药物目前已经被广泛地应用于肿瘤的临床治疗,提示利用传统中药开发新型抗肿瘤药物具有巨大的前景.蟾毒灵是从中药蟾酥中提取和分离的具有地高辛样免疫活性的有效成分,既往研究表明蟾毒灵可以通过诱导细胞凋亡,周期阻滞或细胞自噬而抑制白血病,胃癌,乳腺癌,前列腺癌,黑色素瘤,结肠癌等多种肿瘤细胞增殖.另有报道证明蟾毒灵可以增加骨肉瘤和肝癌细胞对常规化疗药物的敏感性.但是,蟾毒灵对胰腺癌细胞的作用尤其是其作用机制尚未完全阐明,而目前亦缺乏关于蟾毒灵对胰腺癌化疗敏感性影响的研究. 为了进一步阐明蟾毒灵对胰腺癌细胞的作用及可能的分子机制,并明确蟾毒灵对吉西他滨抗胰腺癌作用的影响,本论文进行了以下四部分研究工作. 第一部分蟾毒灵对胰腺癌PANC-1和CFPAC-1细胞增殖的影响 为了明确蟾毒灵对胰腺癌细胞增殖是否有抑制作用,我们选用PANC-1和CFPAC-1这两株胰腺癌细胞为实验模型,以不同浓度的蟾毒灵(50nM,100nM,200nM,500nM,1000nM,2000nM)分别作用于这两株细胞24h,48h和72h,设含0.1%DMSO细胞组为对照组,随后以CCK-8法检测细胞活性的改变.CCK-8结果显示,蟾毒灵可以明显抑制PANC-1及CFPAC-1细胞增殖,且这种抑制作用呈时间,浓度依赖性,即随着作用时间的延长和药物浓度的增加,细胞的增殖抑制率提高,细胞活性下降. 第二部分蟾毒灵对胰腺癌细胞凋亡的影响及可能的分子机制 诱导细胞凋亡是很多抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞增殖的重要机制.我们知道,凋亡过程受到凋亡促进分子及凋亡抑制分子的共同调控,其中研究较多的凋亡抑制分子为Bcl-2,而凋亡促进分子为P53,其他与凋亡调控相关的分子有Bax,Bcr-abl及PML-RARα等.近年来,越来越多的报道证明热休克蛋白可以通过调控凋亡信号通路中的关键分子发挥抗凋亡作用.Hsp27是小分子热休克蛋白家族中的一员,它可以在不同的水平影响内源性和外源性凋亡通路抑制细胞的凋亡促进肿瘤的发生发展.因此,研究以Hsp27为靶点的药物对肿瘤的治疗具有重要意义. 如前所述,蟾毒灵可以在多种肿瘤细胞中通过调控不同的分子通路诱导细胞凋亡抑制肿瘤细胞的增殖,而最近的一项研究表明蟾毒灵可以通过靶向抑制Hsp27在骨肉瘤细胞中诱导凋亡.我们感兴趣的是蟾毒灵对胰腺癌细胞凋亡的影响及其作用机制.因此,在该部分,我们选用PANC-1和CFPAC-1两株胰腺癌细胞为模型,以不同浓度的蟾毒灵(0nM,50nM,100nM,200nM)作用于胰腺癌细胞48h,以适当方法收集细胞,用流式细胞术检测细胞凋亡率的改变;利用western blotting技术检测PANC-1和CFPAC-1细胞中凋亡相关蛋白及其上游调控分子表达水平的改变. 流式检测结果显示,随着药物浓度的增加,PANC-1和CFPAC-1细胞的凋亡比率增加,即蟾毒灵可以诱导胰腺癌细胞发生凋亡,进而抑制肿瘤细胞的增殖.Western blotting结果表明,经蟾毒灵处理后,Hsp27及其下游分子p-Akt在胰腺癌细胞中下调.同时,该研究证明,经药物处理后,pro-caspase-3和pro-caspase-9被激活,而Bax表达水平升高,Bcl-2表达下降,即Bax/Bcl-2的比值增高.根据上述实验结果,我们推测蟾毒灵可能通过抑制Hsp27,进而调控其下游关键的凋亡相关蛋白最终引起细胞发生凋亡. 第三部分蟾毒灵对胰腺癌细胞周期分布及周期相关蛋白表达的影响 抗肿瘤药物可以通过诱导细胞周期阻滞而抑制细胞增殖,如放线菌素D,阿糖胞苷,氟尿嘧啶,依托泊苷及长春新碱等.已有相关报道证明蟾毒灵可在肝癌,膀胱癌,子宫内膜癌等肿瘤细胞中引起细胞周期阻滞抑制细胞增殖活性.那么蟾毒灵是否可以在胰腺癌细胞中诱导细胞周期阻滞?为了阐明这一问题,我们利用PI单染流式细胞术检测了不同浓度的蟾毒灵(0～200nM)处理胰腺癌细胞48h后,PANC-1和CFPAC-1细胞周期分布情况,发现胰腺癌细胞被阻滞在G2/M期;Western blotting技术检测了周期相关蛋白表达,结果显示CyclinB1,CDK1表达水平下降,而p21蛋白表达水平升高. 既往的研究表明,CyclinB1,CDK1是G2/M周期检测点的关键调控蛋白,而p21是CyclinB1-CDK1复合物的抑制分子.在本研究中,western blotting实验结果证明蟾毒灵可以上调p21的表达及抑制CyclinB1,CDK1的表达.因此,我们认为蟾毒灵可能通过上调p21的水平及抑制CyclinB1,CDK1的表达和活性使得胰腺癌细胞发生周期阻滞.但是,蟾毒灵诱导胰腺癌发生周期阻滞的具体分子机制有待于更多的研究进行阐明. 第四部分蟾毒灵在胰腺癌细胞中对吉西他滨的化疗增敏作用 对于晚期和复发转移胰腺癌来说,以吉西他滨为基础的联合化疗是主要的治疗方式,然而胰腺癌细胞对吉西他滨耐药性的产生往往是治疗失败的主要原因之一.已有研究表明,蟾毒灵可以增加肝癌细胞和骨肉瘤细胞的化疗敏感性,但是在胰腺癌中,蟾毒灵对吉西他滨的化疗增敏作用尚未报道.在本论文中,我们以蟾毒灵,吉西他滨,蟾毒灵+吉西他滨分别作用于PANC-1和CFPAC-1细胞48h,加入终浓度为0.1%DMSO的细胞组设为对照组,CCK-8法检测细胞增殖活性.结果显示,与单独应用蟾毒灵或单独应用吉西他滨相比,蟾毒灵与吉西他滨联合应用对胰腺癌细胞增殖的抑制效应明显增强,说明蟾毒灵确实可增加PANC-1和CFPAC-1这两株胰腺癌细胞对吉西他滨的化疗敏感性.

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