摘要：

目的 鼠双微体2(murine double minute 2,MDM2)为原癌基因,编码泛素-蛋白连接酶,负性调控p53蛋白的稳定性和转录活性.MDM2启动子309位的单核苷酸多态性(SNP)可导致MDM2的转录和蛋白表达水平增高,直接抑制p53,削弱其抗肿瘤作用,与慢性淋巴细胞白血病(CLL)的预后密切相关,但该结论仍未达成共识,需进一步大样本研究.本研究探讨MDM2 SNP309与CLL患者临床和生物学特征,MDM2 mRNA表达水平及CLL生存的关系,明确MDM2 SNP309在CLL发病中的作用机制及其临床意义. 方法 采用聚合酶链式反应(PCR)联合DNA序列测定技术分别检测173例CLL患者MDM2 SNP309基因型,p53突变和153例患者免疫球蛋白重链可变区(IgVH)突变;应用间期荧光原位杂交(FISH)技术检测163例患者细胞遗传学异常;多参数流式细胞术分别检测163例和159例CLL患者外周血CLL细胞CD38和ZAP-70的表达;实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)技术检测115例CLL患者外周血单个核细胞MDM2的mRNA表达水平,并分析其与MDM2 SNP309的关系.统计学分析均采用SPSS17.0软件.应用x2检验比较T/T,T/G或G/G基因型与临床指标的关系;不同分组间基因表达水平的差异采用Mann-Whitney U检验;Kaplan-Meier法计算总生存(OS)和无治疗生存(TFS),Log-Rank法进行差异性检验,多元Logistic回归分析MDM2 SNP309与CLL相关指标,P0.05为有显著差异. 结果 173例CLL患者中G/G型占28.9%,T/G型占48.6%,T/T型占22.5%;260例正常对照三种基因型分别占14.2%(G/G),54.2%(T/G)和31.5%(T/T),两组之间具有统计学差异(P=0.001).与MDM2 SNP309 T/T型相比,G/G型明显提高CLL患者发病风险(OR=2.84,95%CI:1.61-5.03, P0.001),而T/G型未明显提高其发病风险(OR=1.25,95%CI:0.79-1.99,P=0.345).MDM2 SNP309基因型与患者性别,年龄,Binet分期,细胞遗传学,IgVH突变状态,CD38和ZAP-70表达无显著性差异(P0.05).不同基因型间OS和TFS亦无明显差异(P0.05).本研究发现MDM2 mRNA水平和MDM2 SNP309基因型密切相关(T/T v G/G, P0.001;T/TvT/G,P=0.026;T/G v G/G,P=0.009).22例p53基因异常(突变或缺失)患者MDM2 mRNA水平明显高于无p53异常患者(P=0.007).MDM2 SNP309 T/T和T/G型中p53异常患者的MDM2 mRNA水平明显高于p53野生型患者(P=0.002;P=0.024),SNP309G/G型p53异常患者的MDM2 mRNA水平与p53野生型患者无差异(P=0.474).进一步分析MDM2 SNP309在p53无异常的CLL患者中的预后意义,发现p53野生型患者中G/G和T/G型MDM2 mRNA水平仍明显高于T/T型(P0.001和P=0.004);MDM2 SNP309 G/G型(中位24个月;95%CI:4.31-43.69个月,P=0.028)和T/G型(中位27个月;95%CI:9.56～44.4个月,P=0.044)患者TFS均短于SNP309 T/T型患者(中位96个月;95%CI:46.29～145.71个月). 结论 MDM2 SNP309 G/G型与CLL发病密切相关;G/G型患者MDM2 mRNA的表达水平明显增高;MDM2 SNP309基因型与CLL患者OS和TFS均无明显相关性,但在p53野生型患者中,三组基因型与TFS相关,但尚需大样本研究验证. 目的 慢性淋巴细胞白血病(CLL)中p53通路异常会导致总生存缩短和治疗耐药.微小RNA(miRNA)为小分子非编码RNA,主要通过与靶mRNA的3'UTR不完全互补,在转录或转录后水平调控靶基因表达.miR-34a为p53下游的直接转录靶标,p53通过miR-34家族介导衰老,细胞周期阻滞和细胞凋亡.本研究探讨CLL细胞miR-34a与p53通路的相关性及其对CLL细胞凋亡的影响. 方法 采用实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)检测81例CLL患者miR-34a的表达水平和66例Bcl-2 mRNA的表达水平;间期荧光原位杂交(FISH)技术检测ATM基因和p53基因缺失;PCR联合测序技术检测p53基因突变及MDM2 SNP309基因型;体外培养40例CLL原代细胞,转染miR-34a mimics和阴性对照(NTC),经72 h培养后,采用Annexin V-FITC/propidium iodide (PI)检测凋亡水平;qRT-PCR检测转染后CLL细胞Bcl-2 mRNA表达水平. 结果 81例CLL患者miR-34a中位表达水平为0.5(0.18～1.95).del(17p13)组和p53突变组miR-34a表达水平明显低于无缺失组和无突变组(P=0.001;P=0.003).del(11 q22.3)组miR-34a表达水平低于无del(11 q22.3)组,但差异无统计学意义(P=0.241).66例CLL患者的miR-34a表达水平与Bcl-2表达水平无显著负相关(r=-0.233, P=0.127).miR-34a的表达和MDM2 SNPS309密切相关.22例MDM2 SNP309 G/G型患者的miR-34a表达水平明显低于23例T/T型患者(P=0.001),与36例T/G型患者无差异(P=0.120).而在64例p53正常患者中,SNP309 G/G型:niR-34a表达水平不仅低于T/T型患者(P=0.003),而且亦低于T/G型患者(P=0.042).在20例del(17p13),p53突变或MDM2 SNP309 G/G型(简称"p53attenuated")的CLL原代细胞中转染miR-34a mimics和转染NTC两组诱导的凋亡水平无显著差异(P=0.649).20例p53正常的原代细胞中转染miR-34a mimics后中位凋亡水平比转染NTC增加11.3%(P0.001).21例原代细胞转染NTC和miR-34a mimics后p53正常(n=10)与"p53 attenuated" (n=11)组间Bcl-2 mRNA的表达水平无明显差异(P=0.443;P=0.240). 结论 p53异常(突变或缺失)患者的miR-34a表达水平显著下降,miR-34a表达水平与MDM2 SNP309密切相关;CLL患者中miR-34a表达水平和Bcl-2 mRNA表达无相关性;miR-34a的过表达可诱导CLL细胞凋亡,但依赖于p53通路;miR-34a的诱导凋亡作用与Bcl-2 mRNA表达无相关性.

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