摘要：

流感是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染性疾病,严重影响了人类的生命健康.近年来,人感染H5N1型 高致病性禽流感病例的频繁出现,新型H1N1病毒开始在世界范围内的传播,H7N9型禽流感病毒首次引起人类的感染,都一度造成了社会的恐慌,流感已经成 为了一个全球性的敏感话题.神经氨酸酶(NA)是甲型和乙型流感病毒的表面蛋白,在流感病毒的感染和复制过程中发挥了重要作用,主要表现在:①催化宿主细 胞表面受体末端的唾液酸与糖蛋白之间糖苷键的裂解,促进新生病毒从感染的细胞中释出;②阻止子代病毒从宿主细胞释出后的聚集;③裂解呼吸道黏膜中的唾液 酸,阻止病毒灭活并促进病毒在呼吸道中的传播.虽然甲型流感病毒NA已经发现了10种亚型,但构成其活性中心的氨基酸序列是高度保守的,这使NA成为抗流 感病毒药物设计的一个重要靶点.自从1999年,zanamivir(商品名Relenza)和oseltamivir(商品名Tamiflu)上市以 来,NA抑制剂成为抗流感的主要手段,也成为抗流感药物领域中的研究热点.随后,多种结构类型的NA抑制剂相继被发现,如苯甲酸类,环戊烷类,吡咯烷类, 多聚体类等.另外两种高效NA抑制剂peramivir(商品名Rapiacta)和Laninamivir(商品名INAVIR)也已经在少数几个国家 上市. 在已获批准的NA抑制剂中,口服剂oseltamivir是抗流感的首选药物,在很多国家及地区被广泛使用.最近几年,针对 oseltamivir耐药的病毒株不断增多,如H5N1型禽流感病毒和多种季节性H1N1,H3N2型流感病毒株,这使oseltamivir的临床应 用受到一定限制.Zanamivir和peramivir分别通过吸入和静脉注射方式给药,虽然使用率低,但也有耐药病毒株的出现.鉴于目前的抗流感形势 及流感病毒的潜在威胁,开发新型,高效的NA抑制剂仍具有重要现实意义. 本研究论文应用基于受体和配体的合理药物设计原理与方法,共设计合成了22类,135个化合物,经两种抗病毒模型初步筛选,发现了两类具有较好抗流感病毒活性的活性先导化合物.论文共分六个章节,主要包括三部分内容,分述如下: 第一部分:通过文献调研,我们发现很多天然产物,如黄酮,查尔酮及其他一些多酚类化合物都能够较好地抑制流感病毒NA的活性,而且在细胞中还表现出一定 的抗流感病毒增殖能力.这些化合物在结构上不符合经典NA抑制剂的药效团特征,与oseltamivir,zanamivir等抑制剂也有很大的差别.为 了寻找一类结构新颖的NA抑制剂,在本研究中,我们根据黄酮类NA抑制剂药效团模型,以2,4-二氨基为基本结构片段,建立了一个结构多样性的小分子化合 物库.另外,对具有弱NA抑制活性的咖啡酸进行修饰,合成了3个系列衍生物.通过体外抑酶活性筛选及结构优化,共得到92个化合物.其中,只有咖啡酸衍生 物具有较高的NA抑制能力,而且在细胞中也表现出一定的抗病毒能力,例如化合物(G3),(G4),(M1),(M2)和(P2)等.进一步的酶抑制动力 学研究表明,本研究发现的咖啡酸衍生物为非竞争性NA抑制剂,这表明这些化合物与经典NA抑制剂的作用位点不同,很可能是通过一种新的结合方式对NA发挥 抑制作用的. 第二部分:本课题组前期发现了一些具有中等活性的L-羟脯氨酸衍生物类NA抑制剂,在此基础上,我们根据五元环NA抑制剂的结构 特征,继续对其进行研究.①将L-羟脯氨酸环上C-4位的羟基变为胍基,在吡咯环氮原子上引入疏水性基团;②在吡咯环氮原子上引入脒基,将L-羟脯氨酸环 上C-4位的羟基变为氨基,通过对氨基的化学修饰,引入疏水基团;③在吡咯环氮原子上引入脒基,将L-羟脯氨酸环上C-4位的羟基变曡氮,利用Click 反应引入三氮唑,得到三类新型化合物.体外抑酶试验显示,这些L-羟脯氨酸衍生物都只具有较微弱的酶抑制活性,与对照药 (oseltamivircarboxylate)相比有很大的差距.分子对接分析发现,这些化合物中引入的基团在空间上不能与酶活性中心的相应位点结 合,这可能是其活性差的主要原因. 第三部分:2006年Nature报道,Group-1的NA(N1,N4,N5和N8)在其活性中心附近 有一个较大的150-cavity,该口袋可以作为一个辅助结合位点用于开发高选择性的NA抑制剂.根据这一结构特点,我们以oseltamivir为先 导化合物,对其结构中的氨基进行修饰,设计合成了取代的胍基类(T系列)和仲胺类(U系列)两个系列,共31个化合物,化学结构经过1H-NMR, 13C-NMR和HRMS确证.经查阅文献证实,所合成的目标化合物均为新型化合物.体外酶抑制活性试验显示,本研究合成的oseltamivir衍生物 大部分具有N1选择性,U系列化合物的活性明显高于T系列.活性最好的两个化合物(U12)和(U19)对N1的抑制活性比oseltamivir羧酸盐 提高了8倍.在鸡胚试验中,(U12)也被发现具有很好的体内抗流感病毒活性.通过计算机模拟对接发现,(U12)中C-5位仲胺氮原子上的联苯甲基片段 能够很好地与150-cavity结合,而其它部分则占据酶活性中心,与晶体结构中oseltamivir羧酸盐的空间结构大体上重合,这证明150- cavity完全可以作为一个辅助结合区用于开发高活性,高选择性NA抑制剂. 结论与总结:本研究利用两种药物设计思路分别发现了两类新型 NA抑制剂,咖啡酸类和oseltamivir衍生物类.咖啡酸本身具有多种生物活性,我们基于咖啡酸设计的部分化合物对于流感病毒在酶和细胞水平上都表 现出较好的活性,优于大部分报道过的活性天然产物.咖啡酸衍生物是一类全新的NA抑制剂,值得进一步进行研究.高致病性H5N1型禽流感病毒和H1N1型 流感病毒是两种对人类威胁最大的流感病毒,自从150-cavity被发现以来,选择性NA抑制剂的研究一直备受关注,然而至今未有进展.我们通过合理药 物设计发现的仲胺类oseltamivir抑制剂,在NA选择性抑制剂的研究方面取得了突破,多个化合物对N1型NA表现出高活性,高选择性,并且超过阳 性对照药oseltamivir.在目前的抗流感病毒形势下,这一发现具有重要意义,为N1型流感病毒的预防和治疗提供了新的研究方向.

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