摘要：

(R)-3-奎宁醇手性中心接有一个活泼的官能团"-OH",是合成多种抗胆碱能药物的手性前体,例如他沙利定、瑞伐托酯、阿地溴铵等。抗胆碱能药物能够有效的缓解并治疗老年痴呆症、慢性阻塞性肺炎等疾病,因此研究(R)-3-奎宁醇的合成在医药领域具有重要的价值。本研究着眼于筛选高效高立体选择性的羰基还原酶,通过不对称还原3-奎宁酮制备(R)-3-奎宁醇。主要研究内容分为以下三部分: 首先,是奎宁酮还原酶的筛选。本研究以目标反应3-奎宁酮还原生成(R)-3-奎宁醇为导向,在基因数据库中进行序列比对挖掘,从Agrobacterium radiobacter ECU2556及Sulfobacillus acidophilus中筛选获得了能高效还原3-奎宁酮生成(R)-3-奎宁醇的还原酶ArQR和SaQR。 其次,奎宁酮还原酶的纯化及酶学性质研究。通过镍柱亲和层析对ArQR和SaQR进行纯化,得出ArQR纯酶的比活为198U/mg,SaQR纯酶比活为42U/mg。酶学性能表征结果显示:ArQR及SaQR的单体分别为29.6kDa,30.6kDa,且功能蛋白均以双亚基形式存在。ArQR在pH7.0,40℃时展示了最高的活力,在30℃,35℃,40℃半衰期分别为89h,8.3h,1.2h；SaQR在30℃,40℃,50℃的半衰期分别为130h,24h,2.5h,且在pH7.0,50℃时展示了最高的活力。Zn2+的添加对ArQR的活力有严重的失活或抑制作用,Ni2+的添加对SaQR的活力有失活作用,EDTA对ArQR活力有明显抑制或失活作用,而对SaQR无明显影响。动力学常数的测定显示ArQR对底物3-奎宁酮的Km值仅为0.4mM,kcat值为116s-1；SaQR对底物3-奎宁酮的Km值为1.67mM,kcat值为92.8s-1。 最后,不对称还原奎宁酮生成(R)-3-奎宁醇的反应研究。本研究成功构建奎宁酮还原酶ArQR与葡萄糖脱氢酶BmGDH串联共表达重组菌,以解决辅酶循环问题,降低成本。考察了串联基因的前后顺序,优化双酶共表达重组菌的诱导条件,并对还原反应体系中催化剂重组细胞的加载量、底物浓度、辅酶NAD+浓度等各项参数进行优化,得到30℃反应时,添加0.1g重组干细胞,底物3-奎宁酮盐酸盐上载量242g·L-1,0.1mM NAD+的条件下,在4.5h内,底物能够完全转化成产物,时空产率高达916g·L-1·d-,光学纯度>99%。迄今报道的所有能催化3-奎宁酮生成(R)-3-奎宁醇的酶或细胞中,ArQR是唯一能够催化>200g/L底物的奎宁酮还原酶,展示了良好的工业应用前景。

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