摘要：

胃癌是严重影响人类健康的消化道恶性肿瘤之一,每年有750,000人死于胃癌.多项研究表明,胃癌的发生和发展与炎症密切相关.慢性炎症反应可以激活趋化因子,生长因子以及活性氧等物质,这些介质可以活化胃肠道细胞的炎症通路增加细胞循环,阻止肿瘤抑制通路,激活癌基因进而促进肿瘤的发生.一旦肿瘤形成后,炎症又会促进肿瘤细胞的增殖分化抑制其凋亡,促进血管新生和转移进一步导致肿瘤的发展.大量的动物模型已经证实慢性炎症与胃癌的发生和发展有着密切的关系.控制炎症反应将会对胃癌的治疗有着关键性的作用.磷脂酶A2 (phospholipase A2, PLA2)是一大类能够在sn-2酯键处对磷脂进行水解的酶类,也是酯类代谢的关键酶之一,它可以分解磷脂产生花生四烯酸(Arachdonic Acid,AA),进一步代谢产生环氧化酶(cyclooxygenase, COX)和前列腺素(Prostaglandin E2, PGE2),引发炎症反应,所以PLA2是炎症反应的扳机点,位于炎症反应的上游,也有着"死亡开关"的称号.多种肿瘤发生和发展与PLA2有着直接或间接的关系.研究发现,与正常胃黏膜相比,胃炎和胃癌患者PLA2呈高表达状态.课题组也在前期工作中通过代谢组学的方式筛选出了PLA2,并发现其与胃癌的发展有着密切的关系.根据其功能和分布共分为五类,其中胞质型PLA2(Cytosolic phospholopase A2, cPLA2)水解膜磷脂产生花生四烯酸,参与多种炎症反应.cPLA2中的cPLA2-IVA或cPLA2a (gene PLA2G4A),是首先被证实的,也是含量最多与炎症关系最为密切的亚型.研究发现cPLA2a作为前炎症因子对胃癌的生物学功能的调控有着重要的作用.环氧化酶2(COX-2)是PLA2分解磷脂产生花生四烯酸后再经过多种酶代谢后的产物,是目前研究较多的与癌症密切相关的炎症因子.在结肠癌患者中经常见到COX-2的高表达,长期服用环氧化酶(COX)的抑制剂一非甾体类抗炎药可以显著降低结肠癌的发病风险.课题组也在前期的工作中发现,COX-2的高表达与胃部肿瘤分化程度和Lauren分型密切相关,提示COX-2可以作为胃癌的一个新的预后指标.中国传统中草药甘草酸(Glycyrrhizic acid, GA)提取自甘草的根部,其药理作用如下:抗关节炎,抗过敏,抗病毒,抗肝毒,抗炎等.经过人体代谢甘草酸最后可以转变为甘草次酸(Glycyrrhetinic acid),甘草次酸是人体内发挥作用的主要形式.研究表明,甘草次酸可以通过抑制cPLA2/AA通路在起始阶段控制炎症反应下调相关炎性介质治疗多种炎性疾病.异甘草酸镁(Magnesium isoglycyrrhizinate, MgIG)是甘草次酸的第四代衍生物,因此我们推测,异甘草酸镁是否通过抑制cPLA2a进一步降低COX-2的表达控制炎症反应进而干预胃癌的发展.本文从两个部分进行研究:第一部分体外研究,不同浓度异甘草酸镁作用于胃癌细胞MFC后筛选出有效作用浓度,通过MTT细胞增殖实验平板克隆形成实验检测药物对细胞增殖的影响,通过流式细胞仪检测药物对细胞周期和凋亡的影响,并观测细胞的形态学改变.PT-PCR实验检测不同浓度药物对cPLA2α和COX-2的基因表达水平的影响,免疫印迹实验检测不同浓度药物对cPLA2α和COX-2的蛋白表达水平的影响.第二部分体内实验,采用如下分组:①荷瘤小鼠+生理盐水空白对照组②荷瘤小鼠+异甘草酸镁低剂量组③荷瘤小鼠+异甘草酸镁高剂量组④荷瘤小鼠+化疗药物(5-FU)组⑤荷瘤小鼠+化疗药物(5-FU)+异甘草酸镁低剂量组⑥荷瘤小鼠+化疗药物(5-FU)+异甘草酸镁高剂量组.观察瘤重和瘤体积变化情况并统计每组实验鼠的生存期,通过HE检测肿瘤组织形态学改变,通过免疫组化和免疫印迹实验检测各组cPLA2α和COX-2表达的变化情况.第一部分异甘草酸镁干预胃癌细胞株MFC增殖的体外实验研究目的:异甘草酸镁作用于胃癌细胞株MFC后,观察在浓度设定范围内对其抑制效应,并在mRNA和蛋白水平检测药物对磷脂酶A2 IVA (cytosolic phospholipase A2 group IVA, cPLA2a)和环氧化酶2(cyclooxygenase 2, COX-2)的抑制作用,并对其可能的作用机制做初步的探讨.方法:不同浓度的异甘草酸镁处理胃癌细胞株MFC后,通过细胞增殖(MTT)实验,筛选出适宜浓度进行后续实验,通过平板克隆实验观察其对细胞增殖的抑制作用,通过流式细胞仪检测药物对细胞周期和凋亡的影响.采用RT-PCR的方法检测其对cPLA2a和COX-2 mRNA水平的影响,采用Western blot的方法检测其对cPLA2a和COX-2蛋白表达水平的影响.结果:在已筛选的浓度范围内,实验组与对照组相比较,胃癌细胞株MFC的增殖能力减弱(p0.05),克隆形成率明显下降(p0.05),促进了细胞凋亡,cPLA2a的mRNA水平和蛋白表达水平明显下调,呈现浓度依赖性,而COX-2的mRNA水平和蛋白表达水平变化趋势不明显.结论:在所设定的浓度范围内,异甘草酸镁可以抑制胃癌细胞株MFC的增殖,并促进其凋亡,其机制可能与抑制cPLA2a的表达有关.第二部分异甘草酸镁干预胃癌发展的体内实验研究目的:615小鼠皮下荷瘤成功后随机分成6组,分别给予不同浓度的抗炎药异甘草酸镁和与化疗药物(5-FU)联合使用后,通过比较各组的瘤重和瘤体积大小,以及生存时间的长短,观察异甘草酸镁对615小鼠胃癌发展的干预作用.观察肿瘤组织HE染色后的形态学变化,并在蛋白水平检测其对磷脂酶A2 IVA(group IVA phospholipase A2,cPLA2a)和环氧化酶2(cyclooxygenase 2, COX-2)的抑制作用.方法:选取4到6周龄的雄性615小鼠72只,建立胃癌MFC细胞株皮下荷瘤小鼠模型,荷瘤成功后随机分为6组,每组12只.组别分别为:荷瘤小鼠+生理盐水空白对照组,荷瘤小鼠+异甘草酸镁低剂量(50mg/kg)处理组,荷瘤小鼠+异甘草酸镁高剂量(200mg/kg)处理组,荷瘤小鼠+化疗药物(5-FU)处理组,荷瘤小鼠+化疗药物(5-FU)联合异甘草酸镁低剂量(50mg/kg)处理组,荷瘤小鼠+化疗药物(5-FU)联合异甘草酸镁高剂量(200mg/kg)处理组.药物作用14天后,通过测量比对各组肿瘤组织的体积,重量以及cPLA2a和COX-2表达的情况探讨异甘草酸镁的抗炎抗肿瘤活性及其作用机制.结果:药物作用14天后,异甘草酸镁高剂量组,化疗药物组,化疗药物与异甘草酸镁低剂量联合应用组以及化疗药物与异甘草酸镁高剂量联合应用组与生理盐水空白对照组相比较,瘤重减轻(p0.05),瘤体积缩小(p0.01),生存时间有所延长(m0.05).cPLA2a和COX-2的蛋白表达水平明显下调.肿瘤组织形态学HE染色没有明显变化.结论:异甘草酸镁在体内可以干预胃癌的发展,其机制可能与抑制炎症因子cPLA2a和COX-2的表达相关.

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