摘要：

目的: 随着人口老龄化程度越来越高,脑血管疾病逐渐成为威胁人类健康的主要疾病,其中缺血性脑卒中的发病率高达70%.缺血性脑卒中有很高的致残率和致死率,给社会和家庭带来很大的负担,越来越引起人们的高度重视.动脉粥样硬化是各种缺血性脑卒中的主要病理基础,目前研究认为,动脉粥样硬化的形成包含"滞留反应"和"损伤反应"两种理论,但其基本过程是由脂质介导的慢性炎症反应过程,主要特征为脂质沉积在血管壁内,引起炎症细胞的大量聚集,在动脉粥样硬化的形成过程中,免疫反应始终贯穿其中,免疫反应和炎症反应共同发挥重要作用.随着动脉粥样硬化的发病率逐渐增加,人类健康受到的威胁正日益增加.同时动脉粥样硬化术后由于局部炎症反应常常发生血管再次狭窄,因此,找到一个缺血性脑卒中的早期预测指标将变得更加意义重大. 近年来,人们对溶血磷脂酸产生了很大的兴趣.溶血磷脂酸具有较强的极性,在水中溶解度较高,在体内的多种生物学过程中发挥重要作用.溶血磷脂酸是血栓形成初期血小板活化的过程中产生的,溶血磷脂酸增高表明血栓形成的风险增高,可成为血小板活化的指标.体外实验证实溶血磷脂酸能使肿瘤细胞发生迁移,已有研究证实溶血磷脂酸可诱导卵巢癌的转移;是急性冠脉综合征的重要危险信号,是一种功能非常丰富的"磷脂信使".本实验通过建造活体SD大鼠颈动脉损伤模型,向颈动脉损伤节段注入溶血磷脂酸,研究溶血磷脂酸对颈动脉损伤后血管炎性反应及狭窄程度的影响. 方法: 1.颈动脉损伤大鼠模型建立 选取健康SD大鼠随机分为三组,麻醉完毕,将大鼠采取仰卧位进行固定,于颈部正中部位进行切开,暴露大鼠左侧的颈动脉系统(包括颈总动脉末端,颈内动脉起始部和颈外动脉起始部).对暴露的颈外动脉远端和其细小分支进行结扎.用血管夹临时夹闭颈内动脉和颈总动脉近心端,阻断血流通过.使用2F Fogarty球囊导管建造颈总动脉的损伤模型,LPA组和PBS组分别向颈动脉损伤节段注入100μ l LPA或PBS,Sham组仅结扎左侧颈外动脉各细小分支及颈外动脉远端,不插入导管及药物处理,造模后第14d处死大鼠,取出损伤部位颈总动脉. 2.组织形态学分析 将3组标本经过包埋切片,切片脱蜡至水,染色,脱水,透明,封片处理后对切片进行镜检并进行图文分析. 3.免疫组化方法测定TLR-4的蛋白表达情况 将固定后的组织制成蜡块,然后再制成切片,经过染色后切片再进行脱水,透明,封片等处理.通过这些免疫组化的方法对标本进行处理后,每张切片在高倍镜下随机选择3个视野,对视野内的TLR-4阳性细胞和内膜细胞计数,得出TLR-4阳性细胞所占百分比,从而判断TLR-4的蛋白表达情况. 4.Western blot方法测定TLR-4的蛋白表达情况 通过Western blot方法将标本进行处理,经过总蛋白抽提,核蛋白抽提,蛋白质定量,转印,封闭,孵育抗体,底物发光等过程获得标本的胶片,将胶片进行扫描,用凝胶图象处理系统分析目标条带的光密度值,从而判断TLR-4的蛋白表达情况. 5.荧光定量PCR检测TLR-4mRNA表达情况 通过荧光定量PCR方法对标本进行处理,经过提取各样本的总RNA,RNA样本的反转录处理等过程,利用紫外分光光度计对提取的RNA浓度进行测定,从而判断TLR-4mRNA的表达情况. 6.统计学分析 采用SPSS17.0软件进行数据分析,对每组数据进行方差齐性检验,两个样本的均数行t检验,获得的P<0.05表示两样本之间的差异具有显著性. 结果: 1.溶血磷脂酸促进颈动脉损伤的炎症反应 HE染色图片显示sham组颈动脉中膜内膜无增厚,无明显狭窄.PBS组可见颈动脉轻度损伤,内膜和中膜亦可见增厚,血管轻度狭窄.LPA组可见颈动脉损伤区域内膜和中膜有明显的增厚,内膜中膜界限不清,血管狭窄较重.HE染色图片显示溶血磷脂酸能够促进颈总动脉内膜损伤后的炎症反应,促进内膜增生. 2.溶血磷脂酸促进TLR-4的蛋白表达 每张切片在高倍镜下随机选择3个视野,对视野内的TLR-4阳性细胞和内膜细胞计数,得出TLR-4阳性细胞所占百分比,求出其平均值.采用SPSS17.0软件进行分析,sham组血管内膜TLR-4蛋白表达极少,PBS组TLR-4蛋白表达有所增加,LPA组TLR-4蛋白表达明显增强.将胶片扫描处理后,各条带均采用凝胶图象处理系统进行分析,获得相应的光密度值.LPA组可见其TLR-4蛋白表达最高,PBS组次之,sham组最少,免疫组化,Western Blot结果显示溶血磷脂酸能够促进颈总动脉内膜损伤后TLR-4的蛋白表达. 3.溶血磷脂酸促进TLR-4的基因表达 将实验获得的数据进行分析.TLR-4mRNA在LPA组表达最高,PBS组次之,sham组最少,Real-Time PCR检测结果显示溶血磷脂酸能够促进颈总动脉内膜损伤后TLR-4的基因表达. 结论: 1.通过向大鼠的颈动脉损伤节段注入溶血磷脂酸可见损伤后的颈内动脉炎性反应增强,内膜有增厚反应. 2.溶血磷脂酸促进动脉粥样硬化形成机制与TLR-4密切相关.

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