摘要：

目的和意义:动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种以炎症,脂质代谢紊乱为特征的异常血管内膜慢性病变,是缺血性心脑血管疾病的病理基础.积雪草酸(asiatic acid,AA)是壮药积雪草中的主要活性物质,既往研究提示其可能具有潜在的抗AS活性,但AA对AS的影响和机理尚未明确.本研究采用高脂喂养ApoE-/-小鼠建立的AS动物模型和脂多糖(LPS)诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞建立的巨噬细胞炎症模型,从体内外深入探讨探讨AA抗AS的作用及作用机制.方法:1.45只SPF级6周龄雄性ApoE-/-小鼠和15只相应的野生型雄性C57BL/6J小鼠给予适应性喂养2W后,ApoE-/-小鼠随机分成3组即AS模型组,AA组(AA,40mg/kg/d,ig)和阿托伐他汀组(Ator,10mg/kg/d,ig),给予高脂饲料(含21%脂肪和0.15%胆固醇)喂养;野生型C57BL/6J小鼠为正常对照组,每日灌胃等体积0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na),普通饲料喂养.18W后,全自动血清生化仪检测血脂四项即血清总胆固醇(TC),甘油三酯(TG),低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量;主动脉全长油红O染色检测AS斑块面积比(%);主动脉根部切片HE染色和Masson染色观察AS斑块形成及胶原沉积情况,并测定斑块面积比(%)及内中膜厚度(IMT);酶联免疫吸附实验(ELISA)测定各组小鼠主动脉匀浆中TNF-α,IL-1β和MCP-1的含量;免疫荧光法检测主动脉根部切片AS斑块中i NOS与F4/80共定位表达(双标法)以及PPARγ,NF-κB的表达情况(单标法).2.小鼠RAW264.7巨噬细胞分为空白组,LPS组,AA组(12.5μM)和AA组(25μM)四组,LPS组和AA组细胞先用0.1%DMSO或不同浓度AA预处理1h,再加入1μg/m L LPS处理24h;空白组细胞采用0.1%DMSO进行同期对照.划痕及Transwell实验检测巨噬细胞迁移功能;ELISA法和Griess法分别检测TNF-α,IL-1β,MCP-1和NO炎症因子的释放;ELISA法检测细胞i NOS含量;流式细胞仪检测细胞ROS水平;观察合用PPARγ抑制剂GW9662对细胞释放TNF-α的影响;激光共焦显微镜下观察了PPARγ,NF-κBp65在体外的表达和核转位的变化.结果:1.动物实验结果显示:(1)高脂喂养18W后,AS模型组小鼠血清TC,TG以及LDL-C水平显著增高,HDL-C则下降(与正常对照组比较,P<0.01),AA组和Ator组则明显降低血清TC,TG,LDL-C和升高HDL-C含量(与AS模型组比较,P<0.01);(2)AS模型组小鼠主动脉出现明显的AS斑块,40mg/kg AA灌胃18W可明显减轻小鼠主动脉AS病理性变化,降低油红O染色中主动脉全长的阳性斑块所占面积比(%),减少HE染色中主动脉根部的斑块面积比(%)以及内中膜厚度(IMT),同时提高AS斑块中胶原纤维的含量;(3)AS模型组小鼠主动脉匀浆TNF-α,IL-1β,MCP-1含量显著升高,主动脉根部切片AS斑块中PPARγ蛋白表达水平降低,同时NF-κBp65,i NOS蛋白表达水平增加,巨噬细胞浸润增加.AA组主动脉匀浆TNF-α,IL-1β,MCP-1含量减少,主动脉切片AS斑块中PPARγ蛋白表达水平升高,同时NF-κBp65,i NOS蛋白表达水平减少,巨噬细胞浸润减少.2.细胞实验结果显示:1μg/m L LPS处理24h后,巨噬细胞发生明显迁移,释放TNF-α,IL-1β,MCP-1和NO增多,细胞i NOS含量提高,ROS水平升高,激光共聚焦显微镜下观察到细胞PPARγ蛋白表达水平降低并抑制PPARγ核转位,同时促进NF-κBp65表达和核转位.AA(12.5μM,25μM)干预可使巨噬细胞迁移动能降低,TNF-α,IL-1β,MCP-1和NO释放减少,细胞i NOS含量降低,ROS水平降低,合用PPARγ抑制剂GW9662后可以拮抗AA的抗炎效应,激光共聚焦显微镜下观察到细胞PPARγ蛋白表达水平升高并促进PPARγ核转位,同时抑制NF-κBp65表达和核转位.结论:1.AA能抑制AS斑块形成,可能是通过调节血脂,抗炎发挥作用.2.PPARγ/NF-κB通路是AA发挥抗AS作用的可能重要机制.

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