摘要：

【研究背景】肿瘤免疫逃逸是限制肿瘤免疫治疗效果的最大障碍,肿瘤可通过多种机制抵抗免疫细胞杀伤,包括能够避免免疫识别的多种肿瘤内在机制,以及在微环境中主动免疫抑制的肿瘤外在机制,这些机制多与免疫检查点有关.免疫检查点在免疫系统中起调节作用,而免疫检查点通路的过度激活可以导致肿瘤免疫逃逸的发生.因此近年来,免疫检查点是恶性肿瘤治疗研究的热门靶点,多种免疫检查点抑制剂进入临床.使用抗体或者抑制剂阻断免疫检查点可以激活免疫细胞的功能,增强免疫细胞毒性及其增殖能力,从而治疗恶性肿瘤.免疫检查点阻断疗法已被FDA批准用于治疗多种类型的肿瘤,包括黑色素瘤,非小细胞肺癌,头颈部鳞状细胞癌等等.但是免疫检查点阻断治疗也存在很多问题,免疫检查点阻断治疗对于部分恶性肿瘤的客观反应率很低,并伴随严重的副反应;多种免疫检查点抗体联合应用虽然能够取得较好的疗效,但治疗费用极其昂贵.因此,寻找针对不同免疫检查点通用性并且安全性较高的药物迫在眉睫.研究发现多种免疫抑制性受体(PD-1,BTLA,TIGIT,NKG2A,SIRP-α等)胞内区均含有一个或数个免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM).当免疫抑制性受体与配体特异性结合时,ITIM中的酪氨酸发生磷酸化,磷酸化后的ITIM主要与蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)结合,从而激活SHP2,传导免疫抑制信号,抑制免疫细胞的激活.这是多种免疫检查点受体的通用信号转导机制.因此,我们设计了一种新策略,即通过阻断ITIM基序与SHP2的相互作用达到同时阻断多种免疫检查点的目的,增强免疫细胞杀伤肿瘤的能力,是一种"通用免疫检查点阻断"的治疗策略.【研究目的】本实验室前期以阻断免疫细胞内SHP2的SH2结构域与免疫检查点受体ITIM的结合为切入点,利用固相多肽合成技术合成了带有穿膜肽TAT的TAT-SHP2-CSH2多肽并利用蛋白质工程技术构建并纯化出了TAT-SHP2-N-SH2重组蛋白.我们预期TAT-SHP2-C-SH2及TAT-SHP2-N-SH2能够竞争性结合ITIM,阻断ITIM与下游分子的结合,从而同时阻断含有ITIM基序的多种免疫抑制性受体的激活,使免疫细胞处于持续活化状态,发挥抗肿瘤效应.本实验室前期研究已证实TATSHP2-C-SH2及TAT-SHP2-N-SH2能显著促进CTL对肿瘤细胞的杀伤活性,显著抑制小鼠移植瘤的生长.NK细胞和巨噬细胞作为机体固有免疫系统中重要的组成部分,在肿瘤免疫中发挥重要作用.NK细胞和巨噬细胞的抑制性受体胞内段也有ITIM,那么多肽及重组蛋白是否也能阻断NK细胞和巨噬细胞抑制性受体ITIM与SHP分子结合,从而促进NK细胞和巨噬细胞的抗肿瘤能力呢?因此本课题的研究目的是通过验证TAT-SHP2-C-SH2及TAT-SHP2-N-SH2能够进入NK细胞和巨噬细胞,通过结合其关键抑制性受体的ITIM基序,阻断抑制性受体下游信号通路,解除肿瘤对NK细胞和巨噬细胞的免疫抑制,恢复NK细胞和巨噬细胞的抗肿瘤活性,为肿瘤的免疫治疗提供新的思路和方法.【研究方法】1.通过激光共聚焦观察带穿膜肽TAT的TAT-SHP2-C-SH2及TAT-SHP2-NSH2进入NK细胞,巨噬细胞的时间;2.通过表面等离子共振(SPR),免疫共沉淀(Co-IP)实验验证TAT-SHP2-CSH2及TAT-SHP2-N-SH2与NK细胞表达的免疫抑制性受体NKG2A,KIR3DL-1相互作用,并与巨噬细胞抑制性受体SIRP-α相互作用;并通过Western Blot检测其对NK细胞,巨噬细胞抑制性受体下游信号分子磷酸化的影响;3.通过Cyto Tox96非放射性细胞毒性实验及实时无标记检测仪检测TAT-SHP2-C-SH2及TAT-SHP2-N-SH2刺激后的NK细胞对人淋巴瘤细胞K562,结肠癌细胞HCT116的杀伤作用;酶联免疫吸附实验(ELISA)测定TAT-SHP2-C-SH2及TATSHP2-N-SH2对NK细胞分泌颗粒酶B,穿孔素的影响;流式细胞术检测TATSHP2-C-SH2及TAT-SHP2-N-SH2对NK细胞脱颗粒标记物CD107a的表达;4.通过流式细胞术,激光共聚焦检测TAT-SHP2-C-SH2及TAT-SHP2-N-SH2对巨噬细胞吞噬人淋巴瘤细胞Raji,结肠癌细胞HCT116的影响;5.分别构建MC38,CT26移植瘤小鼠模型,检测TAT-SHP2-C-SH2及TATSHP2-N-SH2对小鼠移植瘤生长的影响,对小鼠肿瘤组织浸润NK细胞中脱颗粒标记物CD107a的表达及巨噬细胞表型的影响.【研究结果】1.激光共聚焦观察携带穿膜TAT的TAT-SHP2-C-SH2约0.5h进入NK细胞,巨噬细胞,约48h后消失.携带穿膜序列的TAT-SHP2-N-SH2约24h进入NK细胞,巨噬细胞,72h后仍未消失;2.SPR,Co-IP,Western Blot实验证实TAT-SHP2-C-SH2及TAT-SHP2-N-SH2能够与NK细胞表达的免疫抑制性受体NKG2A,KIR3DL-1结合,并上调下游信号分子SYK,ZAP70的磷酸化;TAT-SHP2-C-SH2及TAT-SHP2-N-SH2与巨噬细胞表达的免疫抑制性受体SIRP-α存在相互作用,并上调下游信号分子SYK,AKT的磷酸化;3.Cyto Tox96及实时无标记检测仪检测实验结果显示,与对照组相比,TATSHP2-C-SH2及TAT-SHP2-N-SH2能够显著增强NK细胞对K562,HCT116的杀伤能力;ELISA检测结果显示,与对照组相比,TAT-SHP2-C-SH2及TAT-SHP2-NSH22多肽刺激后的NK细胞分泌细胞毒相关分子颗粒酶B,穿孔素的水平均显著升高;流式细胞术检测结果显示,TAT-SHP2-C-SH2和TAT-SHP2-N-SH2多肽显著上调NK细胞脱颗粒标记物CD107a的表达;4.流式细胞术,激光共聚焦检测实验结果显示,与对照组相比,TAT-SHP2-CSH2和TAT-SHP2-N-SH2能够增强巨噬细胞对Raji,HCT116的吞噬能力;5.动物试验结果显示,与对照组相比,TAT-SHP2-C-SH2和TAT-SHP2-N-SH2治疗组小鼠肿瘤生长均减缓,且平均瘤重减轻.流式细胞术结果显示,TAT-SHP2-C-SH2和TAT-SHP2-N-SH2上调了小鼠肿瘤组织浸润NK细胞中CD107a的表达以及巨噬细胞膜表面M1标志分子CD86的表达.【结论】1.TAT-SHP2-C-SH2和TAT-SHP2-N-SH2均可以进入NK细胞,巨噬细胞;2.TAT-SHP2-C-SH2和TAT-SHP2-N-SH2能够与NK细胞免疫抑制性受体NKG2A,KIR3DL-1相互作用,并上调下游信号分子SYK,ZAP70的磷酸化.TATSHP2-C-SH2和TAT-SHP2-N-SH2与巨噬细胞免疫抑制性受体SIRP-α存在相互作用,并上调下游信号分子SYK,AKT的磷酸化;3.TAT-SHP2-C-SH2和TAT-SHP2-N-SH2能够显著上调NK的细胞毒作用,并能够促进NK细胞分泌细胞毒相关分子颗粒酶B,穿孔素,以及NK细胞脱颗粒标志物CD107a,从而增强NK细胞杀伤肿瘤细胞的活性,提升杀伤效率;4.TAT-SHP2-C-SH2和TAT-SHP2-N-SH2能够显著增强巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力;5.TAT-SHP2-C-SH2和TAT-SHP2-N-SH2具有显著抑制小鼠MC38,CT26结肠癌的作用,并促进了肿瘤浸润的NK细胞和巨噬细胞的活化.

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