摘要：

本论文主要以高分子聚合物芯片作为分析平台,通过对芯片通道表面进行修饰和改性,将蛋白水解酶固定在芯片的通道内,实现了蛋白质高效快速的酶解,可用于蛋白质组学分析研究. 论文的第一章概述了近年来微流控芯片领域在加工方法,制作材料,检测技术及分析应用等方面的研究进展,并强调了对微流控芯片通道表面进行改性和修饰的必要性和重要性;同时,本章详细介绍了蛋白质组学发展概况,主要研究内容,研究现状和主要应用领域等;最后总结了本论文研究的目的及意义. 本论文研究工作分为三章,以聚甲基丙烯酸甲酯和聚对苯二甲酸乙二醇酯微流控芯片作为研究对象,发展了生物聚电解质层层组装法,纳米分子筛组装法,纳米:金胶组装法等表面修饰方法,将胰蛋白酶固定在高分子聚合物芯片微通道内,用于蛋白质的快速酶解和鉴定.特别是结合二维高效液相色谱和生物质谱,将构建的芯片酶反应器用于小鼠巨噬细胞提取蛋白样品的快速酶解,分离与鉴定.同时,对几种固定酶方法的机理,酶活性及吸附酶量等方面进行了系统地研究和探讨.具体内容如下: (一)聚对苯二甲酸乙二醇酯微流控芯片层层组装表面修饰法及其应用研究 1)聚对苯二甲酸乙二醇酯微流控芯片层层组装酶反应器的构建及其在蛋白质快速酶解中的应用 本节着重以聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)微流控芯片为研究对象,通过壳聚糖/透明质酸层层组装作用将蛋白水解酶固定在PET芯片微通道内,实现了蛋白的高效酶解.两种天然生物聚电解质壳聚糖(chitosan,简称CS)和透明质酸(hyaluronic acid,简称HA)具有生物相容性,亲水性,无毒性,对蛋白质等生物大分子有很强的亲和吸附能力.壳聚糖/透明质酸多层膜通过静电引力相互作用可以沉积在PET芯片微通道表面,能够形成一个具有良好生物相容性和亲水性的网状微环境,有助于胰蛋白酶的固定,同时可以保持其生物活性.分别采用原子力显微镜,接触角,全反射红外光谱等表征了CS/HA在PET表面的层层组装过程.这种聚电解质层层组装芯片酶反应器适合于进行快速灵敏的蛋白酶解.与基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)联用,这种聚电解质修饰的微流控芯片酶反应器能够在数秒内酶解低至0.5ng/μl的标准蛋白样品. 2)微流控芯片内自组装生物相容性界面的构建用于实现实际蛋白样品的高效酶解 本节进一步系统研究了PET微流控芯片通道管壁组装不同层数的CS/HA对固定胰蛋白酶在吸附量和酶活性方面的影响.利用石英晶体微天平考察了CS/HA多层膜上组装不同层数胰蛋白酶时对酶吸附量的影响.研究表明四层胰蛋白酶吸附在CS/HA多层膜聚电解质中,酶吸附量达到了饱和状态.除此之外,采用Langmuir吸附等温模型研究了CS/HA多层膜对胰蛋白酶的吸附行为.经过计算得到胰蛋白酶的最大吸附量Γ_(max)=3.6×10~(-6) molm~(-2),吸附常数K=1.6×10~5M~(-1).同时,我们比较了不同层数胰蛋白酶的活性.通过选择最佳的酶固定量和活性,将芯片酶反应器用于fmol级标准蛋白,含不同构型的酪蛋白和减活甲肝病毒疫苗快速酶解鉴定,得到了令人满意的鉴定结果.层层组装微芯片酶反应器为低丰度和实际蛋白样品的快速酶解鉴定提供了一种可行的方法. (二)纳米分子筛在聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片酶反应器中的应用研究 本章重点研究了纳米分子筛对胰蛋白酶的吸附行为及其对低量蛋白的芯片快速酶解鉴定,实现纳米分子筛在蛋白质组学领域新的应用.纳米级尺寸的分子筛材料由于具有比表面积大,在溶液中有良好的分散性,表面性质可调等优点,使得它对生物大分子有特异的吸附能力.分别比较了不同pH值和不同酶溶液浓度下,三种纳米分子筛材料(LTL,Beta,和Silicate-1)对胰蛋白酶的吸附行为.研究表明,和其他两种纳米分子筛材料比较,LTL外比表面积更大,对胰蛋白酶的吸附能力更强,达到5.63 mg m~(-2).除此之外,我们考察了不同胰蛋白酶浓度下,LTL纳米分子筛对芯片酶反应器酶解效率的影响.利用LTL纳米分子筛酶反应器对不同浓度的蛋白质包括牛血清白蛋白,细胞色素c,肌球蛋白进行了快速酶解,得到较高的氨基酸序列覆盖度和蛋白得分.研究表明,纳米分子筛除了可用于低丰度蛋白和肽段的富集外,在实现低量蛋白的快速酶解方面也有着广阔的应用前景. (三)纳米金胶组装微流控芯片反应器用于小鼠巨噬细胞提取蛋白样品的酶解及鉴定 本工作着重研究了纳米金胶芯片酶反应器用于小鼠巨噬细胞提取蛋白样品的酶解鉴定.比较了不同纳米金胶组装层数对吸附酶活性的影响.以同一浓度下的牛血清白蛋白作为底物,考察了不同纳米金胶组装层数对芯片酶反应器酶解效率的影响.研究表明,组装两层纳米金胶时,芯片酶反应器中固定化酶的活性最好,酶解效率最高.与基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱联用,纳米金胶微流控芯片酶反应器在数秒内可以酶解低至16fmol的标准蛋白.难酶解的疏水性蛋白如卵清蛋白,肌球蛋白也得到了比较令人满意的鉴定结果.采用纳米金胶组装的芯片酶反应器对用尿素从小鼠巨噬细胞系AMJ2-C8中提取蛋白样品进行快速酶解,酶解产物用强阳离子交换-反相色谱-电喷雾离子化串级质谱(2D-LC-ESI-MS/MS)分离鉴定,497个蛋白得到了鉴定.这种方法简单,易于操作,有望在蛋白质组学中得到进一步应用,实现快速,高效,在线的复杂蛋白样品的酶解鉴定.

展开